神經干細胞移植對腦缺血再灌注損傷大鼠腦脊液中炎癥因子的影響

李炳乾，張桂龍，余勇波，陳陸馗

(1.東南大學 醫學院, 江蘇 南京 210009； 2.東南大學附屬中大醫院 神經外科, 江蘇 南京 210009)

腦卒中是一種以高發病率、高致死率、高致殘率為特點且對人類健康構成嚴重危害的疾病[1]，其中80%為缺血性腦卒中。缺血性腦卒中發生早期快速再灌注是重要的治療策略，但會引起再灌注損傷，與其相關的急性炎癥反應促進繼發性腦損害[2]。過度的炎癥反應是造成缺血區再灌注損傷的重要因素之一，參與炎癥反應的炎癥細胞及炎癥因子起到了主要的作用。1992年Reynolds與Weiss首次提出神經干細胞(NSCs)這一概念，研究并發現其具有自我更新及分化3個神經譜系的能力[3-4]。本研究向大腦中動脈閉塞再灌注模型(MCAO/R模型)大鼠立體定向注入NSCs，擬通過觀察大鼠腦脊液中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)、轉化生長因子β1(TGF-β1)、白細胞介素10(IL-10)含量的變化，以探討NSCs對大鼠腦缺血再灌注損傷后炎癥因子水平的影響。

1 材料與方法

1.1 NSCs的提取、培養

取1只孕14 d的SD大鼠，脫頸處死，用體積分數75%酒精浸泡5 min消毒，取出胎鼠，取胚胎的海馬組織，用眼科剪剪碎后反復吹打，然后加胰酶消化8～10 min，離心后加入培養基，接種至培養瓶，用無血清培養基(DMEM/F12、2%B27、EGF 20 ng·ml-1、bFGF 20 ng·ml-1、1%雙抗)培養，3～4 d換液1次，6～7 d傳代1次。

1.2 NSCs鑒定及分化后的鑒定

先用多聚賴氨酸包被培養皿，將懸浮培養后的神經球消化吹打成單個細胞后接種在此培養皿中，用分化培養基(DMEM/F12、10%FBS)繼續培養2 d，然后進行免疫染色。

按上述培養5 d后移去培養液，用0.01 mol·L-1的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，再重新加入分化培養基繼續培養2 d。培養結束后在室溫下封閉1 h，分別加入一抗Nestin(1∶200)、Tuj1(1∶1 000)、GFAP(1∶1 000)、MOG(1∶1 000)，4 ℃過夜，然后分別加入相應FITC及Cy3偶聯的二抗(1∶400)，室溫孵育1 h，再分別加入DAPI(0.5 μg·ml-1)10 min，用0.01 mol·L-1的無菌PBS洗滌3次后用熒光封片劑封片，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.3 實驗動物分組及MCAO/R模型的制作

采用改良Longa法制作MCAO/R模型。建立MCAO/R模型3 d后進行NSCs移植。取96只雄性SD大鼠，體重240～260 g，隨機分為假手術組和模型組。假手術組步驟同手術組，但不插入栓線，對模型組術后用Zea Longa評分法[5]評分，將得分1～3分的大鼠隨機分為為實驗組和對照組，加上假手術組最后得到3組老鼠，每組32只。

1.4 細胞移植

本實驗采用經典的立體定向細胞移植法[6]，目前尚未發現此方法有加重神經損傷的可能。2016文獻[7]的NSCs臨床試驗也是通過立體定向進行細胞移植。將懸浮培養的第5代NSCs離心5 min(1 000 r·min-1)，加入少量PBS后將細胞球輕輕吹打成單細胞，將細胞稀釋至1×105μl-1。

實驗組動物于術后3 d在腦立體定位儀定位下于前囟左側3.5 mm、前0.5 mm、深4.5 mm處用微量進樣器注入10 μl細胞；對照組注入等量濃度0.01 mol·L-1的PBS；假手術組不作處理。

1.5 大鼠神經功能評分

分別對各組大鼠在術后1、3、14、28 d 4個不同時間段采用改良大鼠神經功能缺損嚴重程度評分量表(m-NSS)[8]分別從運動功能、感覺功能、平衡能力及生理反射進行評分，正常記0分，總計18分，神經功能缺損越嚴重者得分越高。

1.6 大鼠腦脊液及腦組織的酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測

將大鼠用10%的水合氯醛麻醉后，用1 ml空針從枕大池處抽取約0.1 ml清亮腦脊液，將所取的腦脊液放在-80 ℃冰箱中保存備用；按照ELISA試劑盒(購自上海信帆生物科技)說明書測定所得腦脊液中的TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1含量。

1.7 統計學處理

實驗中所得數據結果均用SPSS 16.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析法進行組間比較。P<0.05為差異具有統計學意義。統計圖由Prism 5繪制。

2 結 果

2.1 NSCs培養及鑒定結果

提取出的NSCs在裝有無血清培養基的培養瓶中培養，在倒置顯微鏡下觀察到NSCs呈球形懸浮生長，且培養時間越長所形成的球越大。巢蛋白(nestin，屬中間絲蛋白)是NSCs的標志性蛋白。將培養至第3代的NSCs行巢蛋白免疫熒光檢測，結果神經球有明顯的熒光顯示(圖1)。

2.2 NSCs分化為神經元的鑒定結果

將培養瓶中已培養14 d的細胞轉移至16孔平板上，撤出生長因子，并加入含有10%胎牛血清的培養基繼續培養，7 d后子代NSCs可分化為神經元、少突膠質細胞、星形膠質細胞。將分化后的細胞行TUJ1、MOG、GFAP免疫熒光檢測，結果，由NSCs分化來的神經元、少突膠質細胞及星形膠質細胞有明顯的熒光顯示(圖2)。

2.3 神經功能缺損嚴重程度評分結果

假手術組的評分均為0分，對照組及實驗組的評分隨著時間的推移均呈下降趨勢，但是從統計結果看實驗組評分下降得更早、趨勢更大，其差異有統計學意義(P<0.05)，提示實驗組移植的NSCs對模型大鼠的神經功能恢復有明顯的促進作用(圖3)。

2.4 ELISA檢測結果

各組腦脊液中TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1含量在不同時間段的比較：假手術組各個時間段的含量沒有明顯變化。實驗組及對照組在早期炎癥因子含量都比假手術組要高，隨著時間的推移其含量逐漸降低，到28 d時與假手術組持平，差異無統計學意義。其中實驗組腦脊液中TNF-α、IL-1β含量在1、3、14 d都低于對照組，IL-10、TGF-β1含量在1、3、14 d都高于對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

3 討 論

缺血性腦卒中是臨床上常見的對神經細胞造成永久性損傷的嚴重疾病。早期恢復缺血區血供有助于減少腦損傷，但其可能導致的缺血再灌注損傷會造成二次損傷。炎癥反應在腦缺血再灌注損傷中神經元的遲發性壞死、神經功能障礙等的發生發展中扮演著重要的角色。研究發現，炎癥因子水平與腦損傷程度有較大關系[9]，所以調節炎癥反應成為抑制神經元凋亡的有效手段，故本研究選取4個經典的炎癥因子(TNF-α、IL-10、IL-1β、TGF-β1)作為研究對象，以期通過檢測腦脊液中炎癥因子的含量來衡量顱內炎癥反應情況。IL-1β和TNF-α都是促炎因子，是腦缺血后促發顱內炎癥反應的較重要的因子[10-11]。IL-1β主要通過促進內皮細胞釋放相關炎性物質，誘導神經元凋亡，從而加重神經細胞的損傷[12-13]。TNF-α可以通過釋放神經毒性物質產生神經毒性作用；激活巨噬細胞，促使炎癥細胞浸潤，誘導神經細胞凋亡，造成神經功能損傷[14-15]。TGF-β1和IL-10均是由調節性T淋巴細胞(Treg細胞)分泌的抗炎因子，可抑制T細胞應答和保持免疫耐受[16]。在腦缺血再灌注損傷中，TGF-β1可起到防止過度炎癥反應、保護神經細胞、減輕腦缺血再灌注損傷的作用。IL-10能抑制TNF-α和干擾素-γ(IFN-γ)的神經毒性作用[17]，減少神經元細胞的調亡。

圖1NSC培養及鑒定×200A、B、C. 依次為培養2、4、6 d時所形成的神經球； D. 巢蛋白抗體熒光染色后； E. DAPI抗體熒光染色后； F. D和E合成

Fig1Neuralstemcellcultureandidentification(×200)

圖2神經干細胞分化后三系鑒定
A.TUJ1抗體熒光染色陽性顯示神經元 ×200； B.MOG抗體熒光染色陽性顯示少突膠質細胞 ×400； C.GFAP抗體熒光染色陽性顯示星形膠質細胞 ×200

Fig2Neuralstemcelldifferentiationafteridentificationofthreelines

近年來隨著干細胞研究的興起，NSCs也以其具有自我更新及自我分化的特點備受關注。NSCs能夠形成新的神經元細胞，釋放細胞因子，改善周圍微環境，減輕神經細胞的損傷，對促進神經功能恢復有一定的作用[18-19]。本研究通過將NSCs立體定向注射到大鼠腦缺血區，通過大鼠的神經功能評分及檢測腦脊液中炎癥因子含量的變化來衡量顱內炎癥反應水平，探索NSCs移植對大鼠腦缺血再灌注損傷后顱內炎癥反應的影響。研究結果顯示：(1)NSCs移植后，實驗組比對照組神經功能恢復得更快、更好，提示NSCs對大鼠顱內神經細胞有保護作用，對腦缺血再灌注損傷后神經功能的恢復有促進作用。(2)從大鼠腦缺血再灌注損傷后的炎癥水平來看，實驗組及對照組大鼠腦脊液中IL-1β、TNF-α、IL-10和TGF-β1的含量不斷下降，此結果符合腦缺血再灌注損傷后炎癥反應的一個正常觸發及衰退的過程。1、3、14 d實驗組IL-1β、TNF-α含量比對照組低，而IL-10、TGF-β1含量比對照組高，提示NSCs移植后能夠使抗炎因子的表達上調，促炎因子的表達下調，從而改善腦缺血再灌注損傷后顱內炎癥免疫微環境，降低顱內的炎癥反應水平，減少炎癥反應對神經細胞的損傷，促進顱腦神經功能的修復。

圖3神經功能缺損嚴重程度評分

Fig3Severityassessmentofneurologicaldeficits

圖4大鼠腦脊液中TNF-α、IL-1β、TGF-β1、IL-10含量的ELISA檢測結果

Fig4ELISAresultsofTNF-α,IL-1β,TGF-β1andIL-10incerebrospinalfluidofrats

NSCs的應用前景十分樂觀，其潛在的治療作用近年研究很多，相信在眾多科研工作者不斷的努力下，NSCs移植很可能為缺血性腦損傷患者帶來福音。

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