丹參酮Ⅰ在腎臟缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用研究

高文強(qiáng)，邱雪峰，李凱，陳蔚，趙曉智，李笑弓，郭宏騫

(1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 南京 210008； 2.東南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210009)

腎臟缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是指缺血的腎臟恢復(fù)血流灌注后損傷反而加重和功能惡化的現(xiàn)象，常見于心血管手術(shù)、創(chuàng)傷、休克、燒傷和器官移植的患者[1-2]，是臨床上急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)最常見的病因。目前RIRI的治療以對癥支持治療為主，缺乏特異性治療手段，探索治療RIRI的新方法有重要的臨床意義。

RIRI是一個復(fù)雜的多因素作用的病理生理過程，其具體發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚，涉及自由基、鈣超載和能量代謝功能障礙等多方面因素，且各因素間又相互轉(zhuǎn)化、相互促進(jìn)[3]，但目前普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激損傷在RIRI的病理生理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]，因此，抗氧化應(yīng)激損傷可作為RIRI治療的一種有效手段。

丹參酮Ⅰ(Tanshinone Ⅰ，T-Ⅰ)為中藥丹參根部的主要有效成分。研究表明，T-Ⅰ能夠發(fā)揮舒張血管、清除氧自由基、穩(wěn)定血管內(nèi)皮功能等藥理作用，對腦卒中、心肌缺血、閉塞性動脈炎及動脈粥樣硬化等心腦血管疾病具有良好的治療效果[5-6]，但其在RIRI中的保護(hù)作用仍然未知，近期多項研究表明T-Ⅰ 通過激活氧化還原反應(yīng)相關(guān)的防御性通路來發(fā)揮抗氧化性[7-9]，提示T-Ⅰ 可能 通過抗氧化作用對RIRI起到保護(hù)作用。本研究通過體內(nèi)、體外兩方面探討T-Ⅰ 在RIRI中的保護(hù)作用，希望為RIRI這一臨床難題探索新的治療手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要材料

普通雄性ICR小鼠(南京醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心)；T-Ⅰ、玉米油(C18H12O3，Aladdin公司，中國上海)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醇(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；人腎小管上皮細(xì)胞HK-2接種于含10%胎牛血清(美國HyClone公司)的高糖DMEM(美國Gibico公司)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，用0.25%胰酶進(jìn)行消化，以1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。試劑及儀器：酶標(biāo)儀(美國Biord公司)，CCK-8試劑盒(Vazyme Biotech)，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(諾唯贊生物科技有限公司，中國南京)，活性氧檢測試劑盒DCFHDA(貝博生物，中國上海)，Tunel細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司)。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 體內(nèi)實驗 將普通雄性ICR小鼠(30～35 g)隨機(jī)分成假手術(shù)(sham)組、sham+T-Ⅰ組、缺血再灌注(IR)組、IR+T-Ⅰ組4組，sham+T-Ⅰ 組及IR+T-Ⅰ 組予腹腔注射T-Ⅰ，劑量為10 mg·kg-1·(48 h)-1[8]，sham組及IR組注射等量玉米油，2周后建立手術(shù)模型，小鼠用1%戊巴比妥鈉(80 mg·kg-1)腹腔內(nèi)給藥麻醉，腹部正中切口，暴露左側(cè)腎蒂，血管夾阻斷左腎血供50 min，切除右腎，逐層關(guān)閉切口。sham組及sham+T-Ⅰ組只切除右側(cè)腎臟，不阻斷左腎血流,術(shù)后48 h留取左腎組織及血清標(biāo)本。

1.2.2 體外實驗 將HK-2按5×104ml-1接種于96孔板或6孔板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)6 h貼壁后，隨機(jī)分為對照(C)組、T-Ⅰ組、H2O2組、H2O2+T-Ⅰ組4組，T-Ⅰ 組及H2O2+T-Ⅰ組用含T-Ⅰ培養(yǎng)基培養(yǎng)，C組及H2O2組用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后用H2O2模擬氧化應(yīng)激模型；H2O2組及H2O2+T-Ⅰ組用含過氧化氫無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，C組及T-Ⅰ組更換無血清正常培養(yǎng)基培養(yǎng)；2 h后檢測比較各組細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)活性氧指標(biāo)。

1.3 小鼠腎功能評估

每組血液樣本經(jīng)離心所得血清存儲于-80 ℃冰箱，用作血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平檢測，評估腎功能。

1.4 小鼠腎臟組織學(xué)分析

用10%福爾馬林固定中間部分腎臟組織，脫水并用石蠟包埋。HE染色，隨機(jī)5 μm厚度切片，對腎臟的損傷程度進(jìn)行組織病理學(xué)評分。評分反映10個隨機(jī)選擇非重疊區(qū)域(200倍)的腎組織損傷(包括腎小管壞死、管型形成、腎小管擴(kuò)張、鮑氏囊擴(kuò)張、刷狀緣消失)所占比例，分級如下：0分，無腎組織損傷；1分，腎組織損傷≤10%；2分，腎組織損傷11%～25%；3分，腎組織損傷26%～45%；4分，腎組織損傷46%～75%；5分，腎組織損傷≥76%[10]。

1.5 小鼠腎臟組織凋亡檢測

利用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，將切好的石蠟切片烘烤、脫蠟、再水化，根據(jù)說明書步驟檢測腎臟細(xì)胞凋亡，通過計數(shù)10個隨機(jī)視野內(nèi)的凋亡細(xì)胞所占比例來反映各組小鼠腎臟凋亡情況。

1.6 小鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

通過測定腎臟SOD活性及MDA含量來反映小鼠腎臟氧化應(yīng)激水平，按照SOD及MDA試劑盒相關(guān)步驟：小鼠腎臟勻漿后15 min、3 000 r·min-1離心，取上清液分別加入SOD、MDA檢測試劑，每個測定重復(fù)3遍。

1.7 腎小管上皮細(xì)胞活力檢測

采用CCK-8試劑盒，將上述處理的96孔板內(nèi)細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，用正常培養(yǎng)基洗滌2次，加入含10% CCK-8試劑的培養(yǎng)基100 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)2 h后，在450 nm波長測定各組吸光度(A)值，設(shè)置不加

細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照組，比色時作為空白調(diào)零孔，每組重復(fù)6孔。細(xì)胞活力=[A(加藥)-A(空白)]/[A(對照)-A(空白)]×100%。

1.8 腎小管上皮細(xì)胞凋亡檢測

將各組細(xì)胞用0.25%胰酶進(jìn)行消化，PBS洗滌3次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105ml-1，加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液100 μl重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI染色液，輕輕混勻且室溫、避光反應(yīng)10 min；每組加入400 μl結(jié)合緩沖液，輕輕混勻后，將樣品在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.9 腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)測量

通過檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧來反映HK-2氧化應(yīng)激狀態(tài)，采用ROS檢測試劑盒：將1.2.2中處理的6孔板內(nèi)細(xì)胞除去培養(yǎng)液并用正常培養(yǎng)基洗滌2遍，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，在激發(fā)波長502 nm、發(fā)射波長530 nm附近，用熒光顯微鏡檢測DCF熒光，從而測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，然后利用Image J對每組的熒光水平進(jìn)行定量分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Tukey’s檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠腎功能變化

術(shù)后48 h各組小鼠血清Cr、BUN水平如圖1所示，sham+T-Ⅰ組與sham組相比血清Cr、BUN水平無明顯差異(P>0.05)，IR組血清Cr、BUN水平明顯高于sham組、sham+T-Ⅰ組(P<0.05)，IR+T-Ⅰ組血清Cr、BUN水平較IR組明顯下降(P<0.05)。

aP<0.05

圖1各組小鼠腎臟血清Cr(A)及BUN(B)水平比較

2.2 T-Ⅰ改善RIRI后腎組織病理學(xué)改變

通過基于急性腎損傷微觀結(jié)構(gòu)的病理評分，包括腎小管壞死、刷狀緣消失、管型形成、腎小管擴(kuò)張等，來判斷T-Ⅰ 對RIRI引起的腎損傷的影響。如圖2所示，在腎臟皮質(zhì)及髓質(zhì)IR組評分均顯著高于sham組及sham+T-Ⅰ 組，且與IR組相比，IR+T-Ⅰ 組評分明顯較低。

aP<0.05

圖2T-Ⅰ改善RIRI后腎組織病理學(xué)改變
A.小鼠腎皮質(zhì)病理學(xué)改變；B.小鼠腎皮質(zhì)組織病理評分；C.小鼠腎髓質(zhì)組織病理學(xué)改變；D.鼠腎髓質(zhì)組織病理評分

2.3 各組小鼠腎組織細(xì)胞凋亡情況

通過TUNEL法檢測小鼠腎臟組織中的凋亡細(xì)胞，結(jié)果如圖3所示，褐色核染代表凋亡細(xì)胞，IR組以及IR+T-Ⅰ組均可見較多凋亡細(xì)胞，且IR+T-Ⅰ組凋亡細(xì)胞較IR組顯著減少。

2.4 各組小鼠腎臟氧化應(yīng)激狀態(tài)

利用腎臟組織中SOD活力及MDA含量來評估腎臟氧化應(yīng)激水平，如圖4所示，與sham組及sham+T-Ⅰ 組相比，IR組SOD顯著降低，而MDA水平明顯升高，提示IR術(shù)后腎臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，而IR+T-Ⅰ組SOD活力較IR組增高，MDA水平下降。

2.5 T-Ⅰ提高腎小管上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷后細(xì)胞活力

圖5A為不同濃度H2O2處理人腎小管上皮細(xì)胞2 h后細(xì)胞活力變化，根據(jù)實驗結(jié)果，后續(xù)實驗使用H2O2終濃度為2 mmol·L-1；圖5B為T-Ⅰ處理HK-2細(xì)胞24 h后細(xì)胞活力變化，提示較低濃度(終濃度≤3 μmol·L-1)處理24 h對HK-2沒有細(xì)胞毒性，后續(xù)實驗選用T-Ⅰ終濃度為3 μmol·L-1；圖5C提示T-Ⅰ對H2O2處理后的HK-2細(xì)胞的保護(hù)作用，H2O2組與C組及T-Ⅰ組相比細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，H2O2+T-Ⅰ組較H2O2組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.05)。

aP<0.05

圖3各組小鼠腎臟組織細(xì)胞凋亡結(jié)果(A)及定量(B)

aP<0.05

圖4各組小鼠腎臟SOD活力(A)及MDA含量(B)比較

2.6 各組腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況

利用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測各組細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果如圖6所示，Q4、Q2分別代表早期及晚期凋亡(圖6A)，定量結(jié)果(圖6B)顯示H2O2組細(xì)胞凋亡比例較C組及T-Ⅰ組顯著增加，而H2O2+T-Ⅰ組較H2O2組有所下降(P<0.05)。

2.7 各組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)活性氧水平變化

利用細(xì)胞內(nèi)活性氧水平來反映各組氧化應(yīng)激狀態(tài)，如圖7所示，綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比，H2O2組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光水平顯著高于C組及T-Ⅰ 組，而與H2O2組相比，H2O2+T-Ⅰ組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度明顯下降，說明T-Ⅰ預(yù)處理可顯著緩解H2O2誘導(dǎo)的HK-2內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)。

3 討 論

RIRI是臨床常見的病理生理過程，在腎移植、心肺旁路及主動脈旁路手術(shù)、出血、創(chuàng)傷、膿毒血癥及腎積水中均可出現(xiàn)[11]，尤其在腎移植過程中不可避免地會出現(xiàn)IR損傷，導(dǎo)致AKI，影響移植后腎功能，甚至引

aP<0.05

圖5T-Ⅰ減輕H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞損傷
A.不同濃度H2O2處理2 h后HK-2活力變化；B.不同濃度T-Ⅰ處理24 h后HK-2細(xì)胞活力變化；C.T-Ⅰ預(yù)處理24 h顯著增加H2O2處理后的細(xì)胞活力起移植后早期死亡率增高[12-13]。如上所述，RIRI的病理生理過程比較復(fù)雜，但目前普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮著重大作用，是導(dǎo)致腎小管壞死、凋亡及加重局部炎癥的主要原因[14]。在缺血過程中，組織缺氧會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP消耗及次黃嘌呤堆積，血液復(fù)流后便產(chǎn)生大量的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS),導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡及腎臟局部炎癥反應(yīng)[14-15]。因此，抗氧化損傷可作為治療RIRI的一種重要手段。已有研究表明，抑制氧自由基形成及抗氧化損傷藥物在RIRI中起到較好的保護(hù)作用[16-18]。

既往研究表明，T-Ⅰ具有強(qiáng)力的抗炎、抗氧化、抗癌作用，由于其分子質(zhì)量較小且具有良好的脂溶性，可以穿透血腦屏障發(fā)揮良好的神經(jīng)保護(hù)作用[9-19]。本實驗通過體內(nèi)及體外兩部分研究證明T-Ⅰ在RIRI中的保護(hù)作用。體內(nèi)實驗IR術(shù)后48 h血Cr、BUN水平及病理組織學(xué)評分表明，T-Ⅰ預(yù)處理能夠顯著改善IR術(shù)后腎功能及腎臟組織結(jié)構(gòu)變化，各組腎臟組織凋亡檢測結(jié)果表明T-Ⅰ能夠顯著減少IR導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，保護(hù)腎臟組織；體外實驗則是通過不同組別HK-2細(xì)胞活力以及凋亡比例變化說明T-Ⅰ預(yù)處理在H2O2模擬的氧化應(yīng)激損傷中有保護(hù)作用。研究表明，T-Ⅰ具有清除氧自由基、抗氧化作用，本實驗經(jīng)測量氧化應(yīng)激指標(biāo)證明，T-Ⅰ通過抗氧化損傷在RIRI中發(fā)揮保護(hù)作用，體內(nèi)實驗中，IR組SOD活性降低及MDA含量升高說明IR術(shù)后腎臟處于強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激狀態(tài)，而與之相比IR+T-Ⅰ組SOD水平升高、MDA含量下降說明T-Ⅰ有強(qiáng)力的抗氧化損傷作用；體外實驗通過檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧水平反映細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，通過比較各組綠色熒光水平可見T-Ⅰ預(yù)處理可顯著降低H2O2誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，發(fā)揮其抗氧化性。有研究表明，T-Ⅰ可以激活體內(nèi)Keap1-Nrf2-ARE抗氧化信號通路發(fā)揮其作用，激活Nrf2之后，可以促進(jìn)其下游抗氧化基因的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化活性[7-8，20]，我們也將對其作進(jìn)一步研究。

總之，本實驗證明氧化應(yīng)激損傷在RIRI中發(fā)揮重要作用，T-Ⅰ通過抗氧化損傷在RIRI中起保護(hù)作用，為RIRI的治療提供了新的方法及理論依據(jù)，也促進(jìn)了祖國中醫(yī)藥相關(guān)學(xué)科的前沿研究，或許將來T-Ⅰ或其衍生物會用于RIRI的治療。

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aP<0.05

圖6各組間細(xì)胞凋亡情況
A.各組間流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果；B.定量分析結(jié)果

aP<0.05

圖7T-Ⅰ緩解H2O2誘導(dǎo)的HK-2內(nèi)氧化應(yīng)激水平
A.各組細(xì)胞內(nèi)ROS水平；B.其熒光強(qiáng)度定量

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