白細胞介素-33對肝癌細胞遷移、侵襲能力和細胞骨架的影響

李凡，夏兵祥，徐健，張業偉

(南京醫科大學附屬腫瘤醫院 普外科,江蘇 南京 210009)

肝癌是常見的惡性腫瘤，在男性死因中位居第5位，在女性死因中位居第8位[1]，其發生轉移和侵襲是術后復發和導致患者死亡的主要原因[2]。腫瘤細胞通常會發生浸潤、擴散和轉移等不同的變化，這個復雜的生理變化過程會涉及腫瘤細胞不同外基質成分的變化，患者宿主細胞與腫瘤細胞之間也存在一系列復雜、多步驟、多因素的連續性相互作用[3]。目前有研究發現，白細胞介素(IL)-33與腫瘤的發生、發展和轉移有關，同時也能激活機體免疫效應機制抑制腫瘤生長[4]。本實驗通過研究IL-33對肝癌細胞遷移、侵襲能力以及對細胞骨架的影響，以期為肝癌的臨床診治方案選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

本研究所涉及的肝癌HepG2細胞株獲贈于中國科學院上海細胞庫，培養基為含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中貼壁培養，傳代培養2～3 d。待細胞培養至對數生長期，取適量細胞分為低濃度、高濃度兩個實驗組和對照組進行實驗。

DHEM培養液和胎牛血清購自美國Hyclone公司；GAPDH抗體、羊抗兔二抗以及抗β-鏈蛋白均購自美國CST公司；抗基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9抗體購自Abcam公司；Matrugel人工重構基底膜材料購自美國BD公司；FITC染料購自美國Sigma公司；穿透小室及PVDF膜購自Millipore公司。

1.2 蛋白質印跡法檢測肝癌細胞MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平

肝癌細胞按照每瓶2×106的標準接種于各個培養瓶中，如上條件進行過夜培養。低濃度、高濃度實驗組肝癌細胞中分別加入低濃度(102U·ml-1)和高濃度(103U·ml-1)的IL-33，對照組加入相應等體積的培養液。各組肝癌細胞經不同處理后繼續培養48 h，然后收集細胞并提取總蛋白，所提蛋白的濃度采用BCA法測定，加熱變性后置于-20 ℃環境保存。取50 μg蛋白行常規蛋白質印跡法檢測MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白的表達水平。

1.3 肝癌細胞表面分子的表達水平檢測

檢測肝癌細胞表面細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、人類白細胞抗原-Ⅰ(HLA-Ⅰ)和CD44的表達水平。取經不同處理的肝癌細胞，加入相應的FITC標記的單克隆抗體(抗-ICAM-1、抗-CD44和抗-HLA-Ⅰ)，在4 ℃下孵育30 min，然后用PBS洗3遍，用流式細胞儀檢測熒光強度。

1.4 細胞附壁檢測

將細胞外基質、纖連素或Ⅳ型膠原蛋白分別加入96孔培養板中，再加入經過不同處理的肝癌細胞(3H-TdR標記)，在37 ℃下孵育不同時間后，收集附壁及殘留的細胞檢測黏附肝癌細胞。

1.5 細胞聚集檢測

取適量經過不同處理的肝癌細胞懸浮液及培養液混合后，置于微量離心管中，在37 ℃下孵育不同時間，期間每10 min振蕩1次，然后加入戊二醛行細胞固定，最后在顯微鏡下觀察并對未聚集的細胞進行計數。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移

取適量肝癌細胞采用0.25%的胰酶進行消化處理，于6孔細胞培養板上分別接種1 ml的單細胞懸液繼續培養約24 h至懸浮細胞基本融合，然后對孔內細胞液進行垂直劃痕處理。取適量PBS液先后沖洗2次后再加入對應濃度的IL-33，陰性對照組加入等體積的培養液，置入37 ℃、5% CO2培養箱中培養，并采用常規光學顯微鏡觀察。在觀察到的每個視野內隨機選擇3個區域，統計在100倍視野下遷移劃痕空隙的長度。

1.7 穿透小室法檢測細胞侵襲

將穿透小室放入24孔板中，在內表面均勻鋪以100 μl Matrigel制作人工基底膜，于無菌環境下過夜處理，實驗前30 min重新成膠，相應對照組不采取任何處理。取不同濃度IL-33處理的實驗組及對照組的肝癌細胞各100 μl細胞懸液，分別接種于已成膠的穿透小室內；另取600 μl含趨化因子的培養液加入至穿透外室并行常規培養，每組設置3次重復。培養16 h后吸除多余培養液，取膜下層細胞，利用多聚甲醇進行固定，并采用0.1%結晶紫進行約10 min的染色處理。制片完成后置于顯微鏡下觀察并統計膜下層的腫瘤細胞數目，每組隨機選取5個視野進行計數，取平均值，設置3次重復。

1.8 高內涵細胞分析系統免疫熒光法檢測細胞骨架

取消化后的細胞懸浮液接種于96孔板，上述同樣環境下培養24 h后給予不同濃度的IL-33處理，而對照組則加入等體積培養液。培養48 h后棄去細胞培養上清，加入多聚甲醛固定，隨后按照畢蕾等[5]的方法進行處理，最后高內涵細胞分析系統讀板獲取數據。

1.9 統計學處理

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以均值±標準差表示，組間比較采用t檢驗，計數資料兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 經IL-33處理后肝癌細胞MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白的表達水平

蛋白質印跡法分析結果顯示，實驗組肝癌細胞經不同濃度的IL-33作用48 h后，MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平較對照組顯著降低(P<0.05)，見圖1。經103U·ml-1的IL-33作用后，肝癌細胞中MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平在24 h和48 h較對照組均降低，尤其在48 h蛋白表達水平降低更顯著，見圖2。這提示IL-33對肝癌細胞中的MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平具有濃度和時間依賴性的作用。

2.2 IL-33對肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ及CD44表達的調節

經低濃度和高濃度IL-33作用后，肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ的表達率較之對照組均顯著增加(P<0.05)，CD44表達顯著下降(P<0.05)，但高濃度和低濃度組間表達率差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1不同濃度IL-33作用下肝癌細胞MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平

Fig1ExpressionlevelsofMMP-2,MMP-9andβ-cateninproteinsinhepatocellularcarcinomacellstreatedwithdifferentconcentrationsofIL-33

圖2高濃度IL-33作用下不同時間肝癌細胞MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平

Fig2ExpressionlevelsofMMP-2,MMP-9andβ-cateninproteinsinhepatocellularcarcinomacellstreatedwithhighconcentrationsofIL-33underdifferencetime

2.3 IL-33對肝癌細胞遷移能力的影響

與IL-33低濃度及高濃度組相比，對照組的肝癌細胞遷移劃痕空隙長度有明顯下降，在48 h后尤為顯著(P<0.05)，可見IL-33對肝癌細胞的遷移有顯著的抑制作用，并表現出一定的時間和IL-33劑量依賴性，見表2、圖3。

表1IL-33對肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ及CD44表達的調節

Tab1RegulationofIL-33ontheexpressionofICAM-1,HLA-ⅠandCD44inhepatocellularcarcinomacells

組 別肝癌細胞表面分子的表達率/%ICAM-1HLA-ⅠCD44對照組12.116.223.3低濃度組25.4a20.7a 14.9a高濃度組29.8a23.3a13.8a

a 與對照組比較，P<0.05

表2IL-33作用下肝癌細胞遷移劃痕空隙的長度

Tab2ThelengthofmigrationgapoflivercancercellsunderIL-33

組 別肝癌細胞遷移劃痕空隙的長度24 h48 h對照組0.63±0.110.43±0.15低濃度組0.88±0.07a0.81±0.09a高濃度組0.91±0.07a0.90±0.05a

a 與對照組比較，P<0.05

圖3不同濃度IL-33作用下肝癌細胞劃痕實驗光鏡照片×100

Fig3LightmicroscopicphotographsofwoundhealingassayinhepatomacellstreatedwithdifferentconcentrationsofIL-33(×100)

2.4 IL-33對肝癌細胞侵襲能力的影響

細胞培養16 h后，經結晶紫染色處理，對照組穿透小室濾膜的細胞數量為148.63±8.93，較IL-33低濃度組(109.48±9.65)及高濃度組(86.53±6.72)差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖4。這提示在一定程度上IL-33可以抑制肝癌細胞的體外侵襲能力，并有一定的劑量依賴性。

2.5 經IL-33處理后肝癌細胞對細胞外基質成分的親和力

經不同濃度IL-33處理后，實驗組肝癌細胞對細胞外基質成分纖維連接蛋白(fibronectin, FN)和Ⅳ型膠原(type Ⅳ collagen)的親和力較對照組均顯著降低(P<0.05)，在40 min和1 h后差異尤為明顯(表3)；同時，IL-33高濃度與低濃度組間差異無統計學意義(P>0.05)。

2.6 經IL-33處理后肝癌細胞的聚集能力

經高濃度和低濃度的IL-33處理后，各組肝癌細胞的聚集能力均呈明顯的下降趨勢(P<0.05)，這也提示IL-33可抑制肝癌細胞的聚集，但高濃度與低濃度組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

圖4不同濃度IL-33作用下肝癌細胞Transwell遷移實驗光鏡照片×100

Fig4LightmicroscopicphotographsofTranswellmigrationinhepatomacellstreatedwithdifferentconcentrationsofIL-33(×100)

2.7 IL-33對肝癌細胞骨架的影響

如圖5所示，只有對照組肝癌細胞的微絲骨架分布較為密集、清晰，面積較大。經IL-33作用后，肝癌細胞F-肌動蛋白構成的微絲顯著減少(P<0.05)，骨架面積分析顯示，高濃度和低濃度IL-33處理后的骨架面積(分別為1 687.63±225.48和1 955.04±198.22)均顯著小于對照組(3 561.42±273.48)。這提示IL-33能有效降低肝癌細胞骨架面積，并表現出一定的IL-33劑量依賴性。

表3經IL-33處理后肝癌細胞對細胞外基質成分的親和力

Tab3AffinityofhepatomacellstoextracellularmatrixaftertreatmentwithIL-33

組 別Ⅳ型膠原的親和力纖維連接蛋白的親和力20 min40 min60 min20 min40 min60 min對照組25.21±4.8332.51±5.6546.84±5.3325.21±4.8332.51±5.6546.84±5.33低濃度組12.43±3.67a15.64±4.25a21.65±4.68a12.43±3.67a15.64±4.25a21.65±4.68a高濃度組10.65±3.44a13.58±3.98a19.54±4.51a10.65±3.44a13.58±3.98a19.54±4.51a

a 與對照組比較，P<0.05

表4經IL-33處理后肝癌細胞的聚集能力

Tab4AggregationabilityofhepatomacellsafterIL-33treatment

組 別肝癌細胞的聚集率20 min40 min60 min對照組57.42±6.5781.62±7.6388.54±5.89低濃度組29.33±5.60a51.32±6.55a53.44±5.21a高濃度組25.44±4.88a47.98±6.23a51.64±6.74a

a 與對照組比較，P<0.05

3 討 論

腫瘤細胞的侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要生物學特性之一，是一個復雜的、多步驟的病理發生過程，包含多基因調控和多層次調節，涉及腫瘤細胞的多個發生環節如細胞增殖、基質降解和細胞遷移等[6]。有研究發現，多個生物學過程在腫瘤的轉移和擴散過程中起著非常重要的作用，如多數腫瘤細胞骨架的重建、腫瘤細胞表面細胞黏附分子的表達、腫瘤細胞與細胞外基質之間的親和力等等[3]。因此，抑制腫瘤發生轉移的有效手段就是阻斷腫瘤細胞的增殖、侵襲，以及該過程所涉及的各個環節、途徑。HepG2是目前在肝癌研究中被廣泛接受的的模式細胞[7]。本研究采用不同濃度的IL-33對肝癌細胞進行干預，通過檢測IL-33對肝癌細胞的增殖及侵襲轉移能力的影響，以期為臨床肝癌的綜合治療和診斷提供相關的參考依據。

圖5不同濃度IL-33作用下肝癌細胞骨架免疫熒光法檢測圖×200

Fig5ImmunofluorescencedetectionofcytoskeletonofhepatomacellsunderdifferentconcentrationsofIL-33(×200)

肝癌HLA-Ⅰ類抗原能夠增加肝癌細胞的免疫原性，可以有效激活毒T細胞對腫瘤細胞的殺傷力，進而增強對腫瘤細胞的滅殺能力[8]。ICAM-1屬于一種免疫球蛋白，機體的淋巴細胞會在ICAM-1與其配體白細胞相關抗原1之間的相互作用下有效地誘導遷移和聚集在腫瘤部位[9]。CD44是一種廣泛存在的細胞表面跨膜糖蛋白，參與腫瘤細胞的異質性黏附，并通過與細胞骨架蛋白相結合，共同促進腫瘤細胞的侵襲轉移[10]。有研究表明，CD44在腫瘤組織中的異常表達可能與腫瘤細胞的轉移具有相關性[11]。IL-33作為白介素家族新近發現的一員，不僅能夠參與基因表達的調控，還能作為細胞因子影響信號通路的傳導[12]，已發現其在患者的炎癥反應和免疫應答中發揮著非常重要的作用[13-14]。

本研究顯示，經低濃度和高濃度IL-33作用后，肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ的表達率較之對照組均顯著增加，CD44表達顯著下降。提示：IL-33能夠增強肝癌細胞的免疫原性，增加宿主T細胞受體依賴性，以加強T細胞對肝癌細胞的殺傷力；而HLA限制性T細胞的細胞毒作用，可以有效抑制腫瘤細胞的遷移能力。此外，本研究結果也顯示，經IL-33處理后，肝癌細胞的聚集能力顯著下降，且肝癌細胞對纖維連接蛋白和Ⅳ型膠原的親和力也顯著下降，細胞劃痕實驗和Transwell系統也發現干預后的肝癌細胞侵襲和遷移能力較之對照組明顯下降，這也進一步表明IL-33能夠抑制肝癌細胞的侵襲和遷移能力。

細胞骨架與腫瘤細胞的運動有關，細胞骨架是由細胞內蛋白質聚合而成的纖維狀網架結構。為了保持細胞特有的形狀，在微觀結構上細胞骨架與位于其內側的核膜及外側的細胞膜具有緊密關系。細胞骨架的主要結構有微絲、微管以及中間纖維，而作為微絲結構的主要細胞骨架蛋白——肌動蛋白，其自身不斷反復地發生解聚和聚合，在腫瘤細胞的形態改變和遷移中起著非常重要的作用[15]。本研究發現，不同濃度的IL-33作用于肝癌細胞后，其F-肌動蛋白構成的微絲顯著減少，提示IL-33可以誘導微絲骨架結構蛋白發生形態改變和重構，使骨架面積降低，抑制腫瘤細胞向外運動和侵襲。

β-鏈蛋白高表達水平可以促進細胞增殖，導致腫瘤發生。有研究證實，肝癌患者β-鏈蛋白的表達程度與患者肝內轉移呈正相關[16]。MMPs是β-鏈蛋白的下游基因產物，是腫瘤侵襲轉移的促進因子[17]，其中MMP-2和MMP-9作為主要金屬酶類均能夠有效降解Ⅳ型膠原。眾多研究表明，兩者在肝癌組織中的表達均呈較高水平，且有報道稱其與肝癌的浸潤及轉移可能具有非常密切的關系[18-19]。本研究中，經不同濃度的IL-33干預后，實驗組肝癌細胞中的MMP-2、MMP-9及β-鏈蛋白表達水平顯著降低，并且存在IL-33濃度和處理時間依賴關系，這提示IL-33能夠通過降低肝癌相關蛋白表達水平，有效抑制肝癌細胞的侵襲遷移。

綜上所述，IL-33能夠通過有效上調肝癌細胞ICAM-1、HLA-Ⅰ分子及降低肝癌相關蛋白的表達水平，減少細胞骨架微絲數量和面積，從而有效抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。

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