飼用酸度調(diào)節(jié)劑中蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、丙酸的同步測(cè)定

鄧 虹，雷 燕

（成都大帝漢克生物科技有限公司，成都 611130）

飼用酸度調(diào)節(jié)劑亦稱pH調(diào)節(jié)劑，是指能夠酸化飼料的一類物質(zhì)?？山档惋暳显谙乐械膒H，為動(dòng)物提供最適消化道環(huán)境，已在國(guó)內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用。是繼抗生素之后，與益生素、酶制劑、微生態(tài)制劑等并列的重要添加劑，是一種無殘留、無抗藥性、無毒害作用的環(huán)保型添加劑。能保證有益菌群合理生長(zhǎng)，病原微生物受到有效抑制，從而達(dá)到提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能和飼料利用率、增強(qiáng)機(jī)體抗病能力的效果[1-3]。目前酸度調(diào)節(jié)劑不僅應(yīng)用在仔豬生產(chǎn)中，在家禽、反芻動(dòng)物上也有積極的效果，市場(chǎng)也出現(xiàn)了各種類型的酸度調(diào)節(jié)劑。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的有機(jī)酸的檢測(cè)方法主要有電位滴定法、毛細(xì)管電泳法、氣相色譜法、液相色譜法等[4-10]。但對(duì)蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、丙酸的同時(shí)檢測(cè)分析還未見報(bào)道，本試驗(yàn)建立了高效液相色譜同時(shí)測(cè)定酸度調(diào)節(jié)劑中的6種有機(jī)酸的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑

本測(cè)定方法中所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682中規(guī)定的二級(jí)水。磷酸二氫鉀：優(yōu)級(jí)純。磷酸：色譜純。乙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞98%，美國(guó)SU?PELCO公司。乳酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞98%，美國(guó)SU?PELCO公司。檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞99%，美國(guó)SUPELCO公司。富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞99%，美國(guó)SUPELCO公司。蘋果酸酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞99%，美國(guó)SUPELCO公司。丙酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度＞98%，美國(guó)SUPELCO公司。

1.2 儀器和設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備。分析天平：感量0.000 1 g。水系濾膜：孔徑0.45 μm。有機(jī)濾膜：孔徑0.45 μm。高效液相色譜儀，配VWD檢測(cè)器。超聲波清洗器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Sepax GP-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀水溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH=3.5），流速：1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm，色譜柱溫度：30±1℃，進(jìn)樣體積：10 μL。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液

分別稱取0.200 0 g（精確至0.000 1 g）蘋果酸，0.200 0 g乳酸，0.200 0 g乙酸，0.200 0 g檸檬酸，0.200 0 g丙酸于100 mL容量瓶中，加20～30 mL蒸餾水溶解，制得溶劑1。稱取富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解后超聲30 min，使難溶于水的富馬酸完全溶解，冷卻后定容，搖勻，取10 mL于溶劑1中。將溶劑1的溶液定容至100 mL，搖勻，此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備、液中蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸的濃度均為2.0 mg·mL-1，富馬酸的濃度為0.1 mg·mL-1，4℃下儲(chǔ)藏，保存期1個(gè)月。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試樣中蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、丙酸含量X，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算公式見式1。

式（1）中，C—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的試樣中果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、丙酸的濃度（mg·mL-1）；V—試樣溶液總體積（mL）；m—試樣的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取0.3～1.0 g（精確至0.000 1 g）酸度調(diào)節(jié)劑樣品于100 mL容量瓶，超聲30min，冷卻后定容，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，等待上機(jī)。從市場(chǎng)上抽取有標(biāo)示含量的3個(gè)酸度調(diào)節(jié)劑樣品，檢測(cè)結(jié)果色譜圖見圖1，保留時(shí)間在2～11 min。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品的高效液相色譜圖

2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按照上述色譜條件進(jìn)行色譜分析測(cè)定。以各有機(jī)酸的峰面積對(duì)其所相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，各線性回歸方程所對(duì)應(yīng)的曲線即為相應(yīng)有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述6種有機(jī)酸對(duì)應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)r見表1，方程中Y即為相應(yīng)有機(jī)酸對(duì)應(yīng)的峰面積，X即為有機(jī)酸的質(zhì)量濃度。精密量取溶液為0.01 mg·mL-1的每種有機(jī)酸溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各種有機(jī)酸的測(cè)得濃度，再計(jì)算6次測(cè)得濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差，3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差即為該酸度調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)限。

2.3 方法的重復(fù)性

連續(xù)檢測(cè)5次樣品1，計(jì)算各有機(jī)酸測(cè)得含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表2。結(jié)果表明，有機(jī)酸進(jìn)樣精密度良好，RSD＜4%。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

在某樣品中分別加入不同量的有機(jī)酸原料，配成6個(gè)已知樣，在相同的色譜操作條件下，定量分析，計(jì)算，測(cè)得各個(gè)有機(jī)酸的回收率見表3。

表1 6種有機(jī)酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限

表2 樣品1中有機(jī)酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差%

表3 樣品1中有機(jī)酸的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

3 討論

3.1 色譜條件

影響有機(jī)酸分離效果主要取決于色譜柱和流動(dòng)相的選擇，色譜柱選用Zorbax Eclipse XDB-C18，Agilent SB-C18和Sepax GP-C18進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Sepax GP-C18能很好的分離6種有機(jī)酸，特別是乳酸和乙酸的分離；流動(dòng)相選用pH 2.5的磷酸水溶液，pH 2.7的0.01 mol·L-1磷酸氫二銨溶液，鹽酸-乙腈溶液,pH 3.5的0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀緩沖溶液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)磷酸二氫鉀緩沖溶液能讓分離效果更加優(yōu)異，而且在11 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。

3.2 前處理的選擇

蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、丙酸均易溶于水，前處理直接加入蒸餾水即可。富馬酸微溶于水，需要超聲或者加熱水才能將其在短時(shí)間內(nèi)完全溶解，且富馬酸的峰響應(yīng)值大，需要單獨(dú)稀釋后再加入混合標(biāo)準(zhǔn)液中。

3.3 實(shí)際應(yīng)用

應(yīng)用建立的方法，從市面上獲得已知含量的酸度調(diào)節(jié)劑進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見表4。

檢測(cè)結(jié)果表明，本方法能滿足對(duì)酸度調(diào)節(jié)劑中蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、丙酸的測(cè)定需求。

表4 已知含量的酸度調(diào)節(jié)劑檢測(cè)結(jié)果

4 飼用酸度調(diào)節(jié)劑應(yīng)用前景

酸度調(diào)節(jié)劑中有機(jī)酸主要作為飼料的酸味劑被廣泛使用，不僅可提高飼料的適口性，促進(jìn)采食，而且具有防腐保健作用，并可預(yù)防飼料被霉菌污染；還具有微生物作用，可減少動(dòng)物胃腸道中有害微生物的繁殖，同時(shí)可降低飼料pH，激活消化酶，有助于消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，為動(dòng)物提供能量等功能[11]。由于這些酸被完全代謝，并安全無毒而被許多國(guó)家批準(zhǔn)用于動(dòng)物飼料的日糧成分，其發(fā)展前景廣闊[12]。

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