比伐蘆定對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響

孔令東 王 耿

（1 遼寧中醫藥大學研究生學院，遼寧 沈陽 110032；2 沈陽軍區總醫院 心血管內科，遼寧 沈陽 110016）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病 (coronary atherosclerotic heart disease，CHD），簡稱冠心病，以冠狀動脈粥樣硬化為主要病機，由于動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS），斑塊形成，管腔面積變小，血流量減少，致心肌缺血缺氧而引起患者胸悶、胸痛等典型心絞痛癥狀[1]。冠心病心絞痛與中醫學中“胸痹”“真心痛”“厥心痛”等疾病在臨床表現上相類似。目前西醫學中針對冠心病的治療，分為抗血小板聚集，抑制炎癥，延緩血管內皮遭破壞；控制血脂，防止冠狀動脈斑塊形成及破裂。而中醫主要以活血化瘀治療。中藥水蛭具有破血通經，逐瘀消癥的功效，而發揮作用的主要為其提取物水蛭素，其具有很強的抗凝作用，同時具有一定的降血脂作用。比伐蘆定是合成的水蛭素的衍生物片段，是新型直接凝血酶抑制劑，具有很強的抗凝作用，本研究根據AS“活血化瘀”的治療理論，觀察比伐蘆定對ApoE-/-小鼠AS的作用。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級ApoE-/-小鼠20只，同齡具有相同遺傳背景的C57BL/6J小鼠10只，體質量18～22 g，8周齡，全部小鼠從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買，許可證號：SCXK（京）2012-0001，雌雄各半。飼養于遼寧中醫藥大學SPF級動物中心，自由攝食與飲水，飼養環境：溫度（22±2） ℃，相對濕度40%～45%。

1.2 藥材、試劑與儀器 TNF-α、IL-6 Elisa試劑盒購于上海酶聯生物科技有限公司；血脂檢測試劑盒從四川邁克生物科技有限公司購買；引物由大連Takara公司設計合成；RIZOL試劑購于大連Takara公司；氯仿購于上海化學試劑有限公司；異丙醇購于上海化學試劑有限公司。酶標儀（美國，Thermo），電泳儀、轉膜儀、化學發光成像系統（上海，天能），7500 Real Time PCR儀（美國，Applied Biosystems）。

2 方法

2.1 動物分組及處理 選擇10只C57BL/6J小鼠作為空白對照組，給予普通小鼠維持飼料喂養，將20只ApoE-/-小鼠隨機分為模型組和治療組，每組10只，給予高脂飼料喂養進行模型復制，飼養12周。于第9周開始，治療組給予比伐蘆定0.25 mg/kg靜脈注射，每2日1次，正常組和模型組給予等體積生理鹽水靜脈注射。于12周末禁食、水24 h后，分離血清、腹主動脈至胸主動脈，分別保存于-80℃超低溫冰箱。

2.2 檢測指標及方法

2.2.1 血清膽固醇水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測3組小鼠血清中膽固醇（TC）、三酰甘油 （TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）。

2.2.2 血清TNF-α、IL-6水平檢測 采用Elisa法檢測各組小鼠血清腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素6（IL-6）水平，具體操作步驟遵照試劑盒說明書進行。

2.2.3 主動脈血管內皮生長因子（VEGF）、金屬蛋白酶-9（MMP-9）、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）mRNA表達水平檢測 采用RT-PCR法檢測各組小鼠主動脈相關基因mRNA表達水平，取100 mg主動脈組織置于研缽中，加入液氮研磨后進行水相分離，加入1 mL Trizol，轉移至1.5 mL EP管中，加入氯仿0.2 mL，離心后吸取上層水相，加入等量異丙醇混合沉淀RNA，離心，緩慢加入75%乙醇洗滌，離心，空氣風干后加入無RNA酶水溶解。紫外吸收測定法，測得260 nm和280 nm OD值，計算RNA濃度和純度。逆轉錄成cDNA模板，采用SYBR Green進行實時熒光PCR（基因及引物序列見表1），反應參數為95℃ 30 s，1個循環；95℃ 5 s，55℃ 10 s，40個循環反應。實驗重復3次，采用ΔΔCt方法進行數據分析。

表1 引物序列表

2.3 統計學方法 實驗數據均為計量資料，用 （x±s）表示，采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，組間比較首先進行單因素方差齊性分析，若方差齊，組間比較采用LSD法檢驗，若方差不齊，組間比較采用Tamhane法檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 3組小鼠血脂水平比較 血脂水平檢測結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P<0.01），HDL-C水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，治療組TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P<0.01），HDL-C水平顯著升高 （P<0.01）。見表2。

表2 3組小鼠血脂水平比較 （x±s，mmol/L）

3.2 3組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 血清Elisa檢測結果顯示，與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-6水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各治療組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P<0.01）。見表3。

表3 3組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較 （x±s，pg/mL）

3.3 3組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達水平比較 RT-PCR檢測主動脈VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF1-αmRNA表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，治療組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF1-αmRNA表達水平明顯降低（P<0.01）。見圖1

圖1 主動脈VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達水平

4 討論

“胸痹”“心痛”為我國傳統醫學中記載的病名，《金匱要略》論述其主要病機為“陽微陰弦”，陽是指主管人體精液運行的功能，陰指有形之精血津液，陽微即人體陽氣不足，推動運化能力不足，導致氣機運行不暢，痰濁瘀血等有形之物積滯于胸中，反過來影響氣機的運行，氣機不通，則引起疼痛，中醫學記載的這一過程與現代醫學中動脈粥樣硬化斑塊的形成機制相類似。中醫學中治療胸痹多以活血化瘀通絡法為主，活血即應用具有行氣活血作用的中藥，使血液運行調和，改善血液流通緩慢的狀態，瘀多是由痰濁瘀血沉積在血脈內，引起脈道不利，化瘀即將附著于脈道內的濁邪消除，使脈道通暢。絡即絡脈，是附著于血脈的小血管，微循環，絡脈不通，亦會阻滯氣機，從而影響周身氣血運行，通絡使絡脈暢達，血液循環無端。總之，活血化瘀通絡能夠使氣機通暢，脈道通利，血液循環正常，從西醫角度來看，活血化瘀通絡之法能夠擴張冠脈，抗血小板聚集，抗凝，防止動脈硬化，穩定斑塊，從而改善血液流變，降低高黏附狀態，改善心肌供氧，進而改善心功能。

中藥水蛭具有破血通經，逐瘀消癥的作用，破血之力較活血之力更強，通經即通暢經絡，逐瘀與化瘀相類似，消癥即消除瘀積于體內的毒邪，整體上也兼具活血化瘀通絡之功效。現代藥理學表明[2]，水蛭的主要有效提取物為水蛭素，能夠延長纖維蛋白凝聚時間，且抑制血小板聚集，改善血液流變學，降低血脂，消退動脈斑塊，增加心肌血流量，對大鼠實驗表明，能夠抑制大鼠體內血栓形成。

天然水蛭素含量極少，目前通過人工化學方法制備水蛭素衍生物片段，將其命名為比伐蘆定，它是一種由20個氨基酸所構成的直接凝血酶抑制劑，相對分子量為2180Da，可直接限制纖維蛋白及凝血酶的形成[3]，其抗凝特性具有直接、特異、短暫、可逆地與凝血酶進行結合的特點[4-5]，作為水蛭素的替代品應用于臨床。

AS與血脂代謝異常和炎癥反應相關，血脂是動脈斑塊形成的基礎，炎癥是誘發斑塊不穩定的重要因素[6]，TC、TG、LDL-C是反映生物體內脂質含量的敏感物質，能夠預測AS風險。HDL-C具有抗氧化、抗炎等作用，其含量越高，冠心病發生風險越低，對冠心病發病有一定預測作用[7-8]。TNF-α、IL-6是生物體炎癥反應的重要指標[9]，AS也存在炎癥反應過程。血管內皮缺氧，易加重脂質氧化，導致蛋白質和核酸變性，從而進一步加重AS進程[10]。缺氧狀態下，HIF-1α由巨噬細胞等合成，具有促進血管新生的功能，促進AS斑塊內炎癥浸潤和平滑肌細胞增殖、遷移，亦能夠促進巨噬細胞泡沫化[11-13]。VEGF是一種能夠特異性地作用于血管內皮的多功能細胞因子，能夠促進AS斑塊中血管新生，同時通過改變血管滲透性而引起血管壁水腫，也會加重AS[14]。MMP-9參與AS斑塊的形成到破裂的全過程，能夠降解細胞外基質的各種蛋白成分，誘發斑塊破裂，形成急性血栓[15]。因此，本研究將TC、TG、LDL-C、HDL-C、TNF-α、IL-6水平作為研究指標，通過檢測VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達水平，能夠很好地反映比伐蘆定對ApoE-/-小鼠AS的影響。

本研究發現，比伐蘆定能夠有效改善ApoE-/-小鼠AS血脂水平，與空白對照組比較，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高（P<0.01），HDL-C水平顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，治療組TC、TG、LDL-C水平顯著降低（P<0.01），HDL-C水平顯著升高（P<0.01）。比伐蘆定能夠有效改善血清炎癥因子水平，與空白對照組比較，模型組TNF-α、IL-6水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各治療組TNF-α、IL-6水平顯著降低（P<0.01）。RT-PCR檢測主動脈VEGF、MMP-9、HIF-1αmRNA表達結果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF1-αmRNA表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，治療組小鼠主動脈VEGF、MMP-9、HIF1-αmRNA表達水平明顯降低 （P<0.01）。

綜上所述，本研究認為比伐蘆定能夠通過改善血脂水平，血清炎癥因子水平及血管新生等方面發揮抗AS作用。

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