清熱解毒法體外抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究※

鄒 文 周 明 侯慧銘 李駿宇 龔 禮

（南昌市洪都中醫(yī)院骨十科，江西 南昌 330006）

抗菌藥物自出現(xiàn)以來，為治療感染性疾病提供了良好條件，但隨著抗生素被廣泛和大量地使用，其毒副作用也凸現(xiàn)出來[1]。長時(shí)間使用抗生素，可致人體菌群的紊亂，并且產(chǎn)生耐藥性，加大了二重感染的幾率，重者甚至可導(dǎo)致耳聾等癥狀的出現(xiàn)。這些危害給治療帶來了難以攻克的難題。作為中醫(yī)清熱解毒的代表方五味消毒飲[2]，五味中藥通過中醫(yī)“君、臣、佐、使”的配伍特點(diǎn)，發(fā)揮五味消毒飲的臨床功效。這也是應(yīng)對(duì)目前濫用抗菌素所帶來的耐藥等問題的研究方向，并有巨大的臨床意義。對(duì)推動(dòng)我國抗炎免疫藥理的發(fā)展及尋求更高效、低毒抗炎免疫藥物起著重要作用。作為清熱解毒的代表方五味消毒飲的臨床療效需要實(shí)驗(yàn)室的驗(yàn)證，對(duì)進(jìn)一步了解其藥理機(jī)制有著十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥液制備 五味消毒飲由金銀花30 g，野菊花、紫花地丁、天葵子、蒲公英各12 g組成。炮制方法：煎煮前用蒸飽水浸泡1 h。第1次加入中藥質(zhì)量6倍的水（約450 mL），先武火煮至沸騰，再用文火煎30 min。收集水煎液用紗布過濾藥液。再加入4倍量水（約300 mL)，浸泡30 min，先武火煮沸后轉(zhuǎn)為文火煮30 min。收集水煎液用紗布過濾藥液。合并2次水煎液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將藥液濃縮成20 mL（即每毫升藥液含原生藥1 g）。在0.1 MPa，120℃條件下滅菌15 min，裝瓶置4℃冰箱保存?zhèn)溆茫浑p黃連口服液10支，生理鹽水。

1.1.2 供試菌株的準(zhǔn)備 供試菌種金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌

1.1.3 培養(yǎng)基制備 營養(yǎng)肉湯：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1000 mL。

營養(yǎng)肉湯制法：按上述成分混合，溶解后用4%NaOH調(diào)節(jié)pH到7.2（用精密pH試紙對(duì)照），121℃高壓滅菌20 min，備用。

營養(yǎng)瓊脂：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液制備 將供試菌株分別接種于培養(yǎng)基中的斜面培養(yǎng)基上活化，經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分離出典型的單個(gè)菌落，然后再轉(zhuǎn)接于肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取1 mL培養(yǎng)液用生理鹽水以10倍稀釋法依次進(jìn)行稀釋，選取0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?.1 mL置于培養(yǎng)皿瓊脂上，用無菌涂布器輕輕將菌液涂勻，經(jīng)37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，用無菌生理鹽水沖洗菌落，并用無菌生理鹽水稀釋菌液，與麥?zhǔn)媳壬軐?duì)比調(diào)整其濃度達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(McF)而配成1.5×108cfu/mL密度的菌液。

1.2.2 五味消毒飲藥物敏感性測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法 （K-B法）[3]：（1） 紙片制作：實(shí)驗(yàn)前1天，選取直徑為6 mm，吸水力為20μL的專用藥敏紙片，分別浸泡于五味消毒飲、生理鹽水中。使之完全浸透，將含藥物的紙片密封保存于2～8℃無霜冷凍箱內(nèi)保存。使用前1～2 h將存儲(chǔ)容器移致室溫平衡，以避免開啟時(shí)產(chǎn)生冷凝水。（2）涂布接種：取無菌棉拭蘸取菌液，在試管壁旋轉(zhuǎn)擠去多余菌液后在培養(yǎng)皿表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1周。（3）貼含藥紙片：平板在室溫下干燥3～5 min，用無菌鑷子將含藥紙片緊貼于培養(yǎng)皿表面，紙片距平板內(nèi)緣應(yīng)大于15 mm；（4）讀取數(shù)據(jù)：置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小，用游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。見圖1。

參照《微生物和檢驗(yàn)技術(shù)》[4]判定結(jié)果。結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)為：抑菌圈直徑≥20 mm為高度敏感；抑菌圈直徑為10～19mm為中度敏感；抑菌圈直徑＜10 mm為低度敏感。

圖1 K-B法

1.2.3 最小抑菌濃度測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用試管二倍稀釋法[5]：測(cè)定40支試管分別插入4個(gè)試管架中，分成4組，將4個(gè)試管架標(biāo)記好，4組分別為金葡菌組、溶血性鏈球菌組、大腸桿菌組、綠膿桿菌組。每組10只試管分別置入2.0 mL營養(yǎng)肉湯。從第1管開始加入藥液2.0 mL，混勻，連續(xù)倍比稀釋至第8管，第8管吸出2.0 mL棄去，分別標(biāo)出1～8號(hào)試管的濃度。使藥液依次稀釋成：1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256 （即濃度依次為：500.00，250.00，125.00，62.50，31.25，15.63，7.81，3.91原藥材mg/mL)。然后，除第9管外，用無菌移液管在其余試管再加入菌懸液100 μL。1～8號(hào)試管為實(shí)驗(yàn)組 (含營養(yǎng)肉湯、菌液、藥液），第9支管為陰性對(duì)照組（只含營養(yǎng)肉湯），第10支管為細(xì)菌生長陽性對(duì)照組（含營養(yǎng)肉湯、菌液）。其中細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌）在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將上述試管中的培養(yǎng)液，每支試管中吸取1 mL移種于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)，以平皿上菌落數(shù)小于陽性對(duì)照為五味消毒飲對(duì)該菌種的最小抑菌濃度。見圖2。

圖2 二倍稀釋法

2 結(jié)果

2.1 供試中藥藥物敏感性 結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌對(duì)五味消毒飲提取液高度敏感，大腸埃希菌、綠膿桿、乙型溶血性鏈球?qū)ξ逦断撅嬏崛∫褐卸让舾小Ｒ姳?。

表1 五味消毒飲提取液對(duì)4種常見菌的抑制結(jié)果 （x±s，mm)

2.2 最小抑菌濃度 量取連續(xù)倍比稀釋的五味消毒飲提取液與稀釋菌液恒溫培養(yǎng)，玻璃皿涂板測(cè)定五味消毒飲提取液對(duì)不同菌株的最小抑菌濃度。結(jié)果表明，五味消毒飲有效成分中含有抑菌成分。五味消毒飲對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、綠膿桿菌、乙型溶血性鏈球菌均有不同程度的抑菌作用，五味消毒飲對(duì)金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為31.25 mg/mL，對(duì)大腸埃希菌的最小抑菌濃度為62.50 mg/mL，對(duì)綠膿桿菌的最小抑菌濃度為125 mg/mL，對(duì)乙型溶血性鏈球菌的最小抑菌濃度為125 mg/mL。見表2。

表2 五味消毒飲最小抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果

3 討論

近些年來，抗菌藥物問題已經(jīng)越來越凸顯，全社會(huì)越來越多地將焦點(diǎn)放在中醫(yī)對(duì)圍手術(shù)期抗菌效果的研究上。中醫(yī)中藥學(xué)中的清熱解毒法在治療病毒性感染方面有著很好的臨床效果，前人也積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)。而其自身的組方特點(diǎn)和配伍方法，完全不同于西醫(yī)治療機(jī)理，具有一定的優(yōu)勢(shì)和臨床價(jià)值。

現(xiàn)代藥理研究和臨床實(shí)踐證實(shí)，中藥在臨床使用時(shí)可以在不破壞組織的原有結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，發(fā)揮抗菌作用，不僅可以直接殺滅病菌，并且能阻止細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的復(fù)制，最后還可以通過提高人體免疫細(xì)胞的識(shí)別和吞噬作用，從而阻止人感染病菌，起到雙向調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)的作用[6]。這也是中醫(yī)“扶正不留邪，祛邪勿傷正”治療特點(diǎn)的體現(xiàn)[7]，由此可見，其藥學(xué)基礎(chǔ)是抗菌作用，這也成為判斷中藥能否發(fā)揮抗菌作用的臨床基準(zhǔn)。

五味消毒飲作為清熱解毒法的代表方，自收載成方的200余年以來，其使用人數(shù)、適用范圍不斷增加，不僅減少了病人的痛苦，也為我們后繼者積累了豐富使用經(jīng)驗(yàn)。進(jìn)入新世紀(jì)以來，人們對(duì)于中醫(yī)科學(xué)的呼聲不斷增高，這要求我們?cè)诶^續(xù)使用好經(jīng)方五味消毒飲的同時(shí)，對(duì)其藥理機(jī)制、配伍特點(diǎn)進(jìn)行研究，并結(jié)合臨床療效的觀察，才能更好地發(fā)揮五味消毒飲的作用。

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