黑麥草抗氧化酶對Cd、Zn和Pb復合污染的響應

張 軍，王文科，耿雅妮，任雪盈，王周鋒，曹書苗

（1.長安大學旱區地下水文與生態效應教育部重點實驗室，西安 710064；2.寶雞文理學院陜西省災害監測與機理模擬重點實驗室，陜西 寶雞 721013）

土壤重金屬污染，尤其重金屬復合污染，具有影響范圍廣，持續時間長，隱蔽性強，不易被發現且不可逆的特點[1]。植物修復作為清潔、有效的土壤污染修復方法，被廣泛應用，但是重金屬也會對植物本身造成毒害[2]，導致植物枯萎甚至死亡。植物可以通過自身解毒機制特別是抗氧化酶系統來減輕這種危害，對于具有一定重金屬富集能力的植物，例如龍葵、東南景天等植物對重金屬表現出很強的耐性和抗性[3-5]。國內外研究表明，植物抗氧化酶系統可以清除重金屬產生的活性氧自由基，其中最主要的抗氧化酶是過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）[6]，3種抗氧化酶隨著重金屬種類[7-8]、濃度[9]和植物類型不同[10]，分別表現為激活或抑制作用。在一定重金屬脅迫水平下SOD活性和細胞內的活性氧自由基水平呈正相關，POD活性與植物體內重金屬濃度呈正相關[11]。

黑麥草（Lolium perenne L.）是我國北方常見的優質草坪草，種植方便，有很強的再生能力，不僅對多種重金屬有很好的富集能力，而且對重金屬脅迫有很強的耐性和抗性[12-13]。研究表明，黑麥草抗氧化性酶對土壤重金屬污染都有明顯響應，單一重金屬污染可以激發CAT、SOD、POD活性，重金屬復合污染對酶活性增加具有協同作用[14-15]。其中，Cd對黑麥草SOD、POD活性都有激活作用，呈現出先增加后降低的趨勢[16]，Pb在低濃度、短時間內可以使黑麥草SOD活性明顯升高，但POD活性隨著Pb濃度升高隨之降低[17]。以前的研究多集中在單一重金屬或兩兩復合重金屬污染上，對多種重金屬復合污染植物抗性酶響應機制研究較少，因此可以探索利用黑麥草抗氧化酶對重金屬污染的響應特征，篩選敏感性指示指標來預報土壤重金屬污染程度[18]。

鑒于重金屬復合污染在環境中普遍存在，許多環境效應都無法采用單一污染物機理來解釋，因此本研究選擇土壤中污染嚴重的Cd、Zn和Pb作為污染來源，采用復合和交互正交實驗方法，以黑麥草為實驗生物，研究重金屬復合污染對黑麥草抗氧化酶活性的影響，以期為土壤重金屬污染植物修復和污染識別提供理論依據。

表1 實驗土壤理化性質Table1 The physical-chemical properties of the experimental soil

表2 正交實驗設計Table2 Design of orthogonal experiment

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

土壤采自陜北延安鐮刀灣地區黃土，采用多點布設方法采取0～20 cm表層黃土，裝入密封袋中帶回實驗室風干，去除碎石、植物殘根等。然后過20目篩，存放待用。按土壤農化的常規分析法[19]測得土壤的理化性質見表1。土壤中重金屬含量采用微波消解-ICPMS（NexION 350X，PE，美國）測定；稱取土壤樣品0.150 0 g，采用 HNO3-HCl-H2O2微波（MDS-10，上海新儀）法消解，同時制作空白，并用標準液進行校正，同時采用國家標準土樣（GSS-8）進行質量控制，回收率為97%～103%，RSD≤5%。所有酸均為優級純，水為超純水（＞18.2 MΩ）。

1.2 實驗設計

選取3種植物抗氧化酶CAT、POD、SOD為指示指標，Cd、Zn、Pb的量和培養時間作為實驗因素，設計正交實驗因素和水平表（如表2）。Cd、Zn、Pb和時間復合作用實驗采用L16（45）復合正交表，3種重金屬交互作用實驗采用L8（27）交互正交表。重金屬指標水平設計參照土壤環境質量標準（GB 15618—2008）和相關文獻確定[14，16-17]，Cd、Zn、Pb 分別以 CdCl2·2.5H2O、Zn（NO3）2·6H2O 和 Pb（NO3）2配制水溶液的形式加入到土壤中，充分攪拌，平衡3周后待用，每處理3個重復。

黑麥草種子先用1%酒精消毒2 min，再用去離子水清洗，然后澆濕放入光照生化培養箱（PGX-450L，寧波賽福），在光照充足恒溫處發芽。待7 d發芽后移植到花盆中，每盆保留幼苗30株，每日早晚澆水，保證含水率為田間含水率的60%。1周后施入少量N、P肥，植物發育吸收后每7 d對植物葉片進行采樣，在植物生長期35 d內共采樣4次，按照1.3測試方法測試樣品。

1.3 測試指標與方法

稱取1.0 g左右新鮮葉片測定抗氧化酶（SOD、POD、CAT）指標：參照 Marklund 等[20]測定方法，將葉片放入冷凍缽體中，加入磷酸溶液，在冰浴下研磨成漿，冷凍離心后取酶上清提取液，由抑制劑氮藍四唑（NBT）在光下還原作用來確定SOD活性，一個酶活性單位由NBT光還原50%來表示；參照Polle等[21]測定方法，用愈創木酚比色法測定POD活性，以1 min內470 nm吸光度變化0.01單位來表示酶活性；測量酶上清液240 nm下吸光率的變化速度來反映過氧化氫分解，以1 min內減少0.1的酶量為1個酶活單位，用紫外分光光度法（DR6000，HACH，日本）測定CAT活性[22]。

1.4 數據處理

采用Excel 2007進行數據處理，采用SPSS v22.0進行正交實驗方差和差異顯著性分析（Duncan，P＜0.05），采用 Origin8.5 作圖。

表3 L16（45）復合正交實驗結果Table3 Results of combined orthogonal experiment，L16（45）

2 結果與分析

2.1 Cd、Zn、Pb復合作用對黑麥草抗氧化酶活性的影響

由表3可知，在表中16組實驗數據中，T6組的CAT活性值最大，T3組的POD活性值最大，T4組的SOD活性值最大。由極差分析可知，各實驗因素對CAT影響順序依次為培養時間＞Cd＞Zn＞Pb；對POD影響順序依次為培養時間＞Pb＞Zn＞Cd；對SOD影響順序依次為培養時間＞Pb＞Zn＞Cd；由此可見，培養時間對植物3種抗氧化酶都是主要影響因素，重金屬Cd對CAT活性有較大影響，Pb對POD、SOD活性有較大影響。

表4中的復合作用方差分析結果顯示，3種氧化酶活性對 Cd、Zn、Pb 均無顯著響應（P＞0.05）。培養時間對CAT活性有較顯著影響（P＜0.1），對POD活性和SOD活性有顯著影響（P＜0.05）。同時，結合表3可以得出，CAT對Cd、Zn的方差和較大，對Cd、Zn濃度響應較敏感，當 Cd 為 10 mg·kg-1，Zn 為 150 mg·kg-1的較小濃度時，CAT活性值達到最大3 731.4 U·min-1·g-1FW，表明低濃度的Cd、Zn對CAT活性具有激活作用；POD、SOD對Pb的方差和較大，表明POD、SOD對Pb較敏感，當Pb為500 mg·kg-1，POD活性值達到最大 2 757.6 U·min-1·g-1FW，當 Pb 為 900 mg·kg-1，SOD活性值達到最大1 577.8 U·min-1·g-1FW，表明中濃度的Pb對POD活性具有激活作用，高濃度的Pb對SOD活性具有激活作用。

2.2 Cd、Zn、Pb的交互作用對黑麥草抗氧化酶活性的影響

如表5可知，在交互正交實驗8組數據中，S3的CAT活性值最大，S8的POD活性值最大，S4的SOD活性值最大。由極差分析可知，各實驗因素對CAT影響順序依次為 Zn×Pb＞Cd×Zn＞Pb＞Cd×Pb＞Zn＞Cd；對POD 影響順序依次為 Zn＞Pb＞Cd×Pb＞Cd×Zn＞Cd＞Zn×Pb；對 SOD 影響順序依次為 Cd×Zn＞Zn×Pb＞Pb＞Cd×Pb＞Cd＞Zn。

由表 6 中方差分析結果可知，Cd、Zn、Cd×Zn、Pb、Cd×Pb、Zn×Pb這些因素都對SOD活性有顯著影響（P＜0.05），對CAT活性和POD活性無顯著影響。

表4 L16（45）復合作用正交實驗方差分析Table4 ANOVA for combined orthogonal experiment，L16（45）

表5 L8（27）交互作用實驗結果Table5 Results of interaction orthogonal experiment，L8（27）

表6 L8（27）交互作用正交實驗方差分析Table6 ANOVA for interaction orthogonal experiment，L8（27）

2.3 Cd、Pb和Zn主效應對黑麥草抗氧化酶活性的影響

重金屬濃度對抗氧化酶活性影響如圖1A～圖1C所示，不同培養時間對抗氧化酶活性影響如圖1D所示。圖1A表明，CAT活性在Cd不同濃度水平均與對照有顯著差異（P＜0.05），在 Cd 濃度為 10 mg·kg-1時酶活性最高，為對照的225%，后隨Cd濃度增加酶活性逐漸降低趨于平穩。POD活性在Cd濃度為30、50 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的127%和138%。SOD活性在Cd不同濃度下均比對照值低，在Cd濃度為10、50 mg·kg-1時明顯小于對照（P＜0.05），分別為對照的78%和56%。說明隨著Cd濃度增加，CAT、POD活性逐漸升高，起激活作用，SOD活性總體呈降低趨勢，有明顯的抑制作用。

圖1B表明，Zn濃度在150 mg·kg-1時CAT活性最高，為對照的138%，在550 mg·kg-1時為最低，是對照的71%。POD活性在Zn濃度350 mg·kg-1時最高，為對照的114%，550 mg·kg-1時最低，為對照的78%。SOD活性在Zn濃度150、550 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的191%和206%。說明隨著Zn濃度的增加，總體來看，對CAT、POD活性為先升高后降低，起抑制作用，對SOD先升高然后降低再升高，起激活作用。

圖1C表明，CAT活性在Pb濃度為100、500、900 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的77%、72%和54%。POD活性在Pb濃度為100、500 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的132%和123%。SOD活性在Pb濃度為100、500、900 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的49%、70%和149%。說明CAT活性隨Pb濃度升高逐漸降低，起抑制作用，POD活性在低濃度升高，高濃度降低，為先促后抑作用；SOD活性先降低后升高，在高濃度下表現為激活作用。

圖1D表明，從14 d到35 d，CAT和SOD活性隨著時間增長，酶活性一直在升高，起激活作用，CAT和SOD活性在35 d時達到最高，分別為對照的527.5%和637.4%。對POD活性來說，在第21 d時酶活性下降。在第28 d時酶活性明顯升高，達到對照的260%，第35 d時酶活性又下降，POD活性隨時間的變化先低后高，隨著時間上下波動并逐漸平穩。

3種抗氧化酶和重金屬濃度之間的多元回歸方程如式（1）～式（3）所示。從式（1）～式（3）可得，Cd對CAT、POD、SOD 活性的回歸系數分別為 141.2、140.2、-81.7，Cd表現為對CAT、POD活性的激活作用，對SOD活性的抑制作用。同理，Zn、Pb表現為對CAT、POD活性的抑制作用，對SOD活性的激活作用。多元回歸方程的分析結果與以上方差分析結果相符。

式中：YCAT、YPOD、YSOD分別代表 CAT、POD、SOD 3 種植物抗氧化酶值。

圖1 不同Cd、Pb、Zn濃度及時間對黑麥草3種抗氧化酶活性的影響Figure1 Effect of different cadmium，zinc，lead and time on three antioxidant enzyme activities in ryegrass

3 討論

重金屬污染對植物抗氧化酶的影響已經有所報道[23-27]。CAT、POD、SOD抗氧化酶是植物適應外部污染脅迫的保護性酶，在外部重金屬脅迫下可以協同清除由其產生的活性氧基團（Reactive Oxygen Species，ROS），從而保護植物細胞不受到破壞[28-29]。在本研究中，單一變異源Cd、Zn、Pb對3種植物抗氧化酶活性影響變化不大，但Zn和Pb相比較Cd來說，對POD活性影響較顯著，當Zn濃度為550 mg·kg-1時，POD活性僅比對照下降了21.7%，當Pb濃度為900 mg·kg-1時，POD活性僅比對照下降了10.9%，無顯著變化，表明POD在去除Zn和Pb引起的自由基中起主要作用[16]，這與徐衛紅等[14]、王晨等[30]的研究結果一致。本研究中，正交復合實驗設計下，低濃度Cd、Zn對CAT酶活性具有較大影響，中、高濃度的Pb對POD、SOD酶活性具有較大影響，而培養時間對3種抗氧化酶活性具有顯著影響，隨著培養時間的延長，CAT和SOD活性呈升高趨勢，表明這2種抗氧化酶一直都在起著清除植物體內自由基的作用。且在長時間（28 d和35 d）重金屬脅迫下，CAT和SOD都顯著高于對照（P＜0.05），表現為隨時間的激活效應。在正交交互實驗中，CAT活性對Zn×Pb、Cd×Zn交互作用最敏感，POD活性對Zn、Pb及Zn×Pb交互作用最敏感，SOD 活性對 Cd×Zn、Zn×Pb 交互作用最敏感，這與單一重金屬脅迫下黑麥草抗氧化酶活性變化有所不同[8，16-17]，表明在復合重金屬污染下，酶活性并非單一重金屬影響之和，而是表現為協同或拮抗作用，激發了植物抗氧化酶長期處于較高水平，防止膜脂過氧化作用而導致細胞死亡。重金屬交互明顯增強了CAT、SOD酶活性響應，這一結果可能與黑麥草細胞解毒機制以及重金屬之間的交互作用相關[31]。

植物在重金屬脅迫下，可以通過多種機制和途徑消除重金屬產生的毒害，特別是通過抗氧化酶清除過量的ROS，達到解毒的目的[32]。本研究交互實驗的結果顯示，重金屬Cd、Zn、Pb復合污染對SOD活性影響最顯著（P＜0.05），尤其是 Cd×Zn，其次是 Zn×Pb，Zn 的存在可以加大Cd、Pb對植物抗氧化酶的影響，尤其是增強SOD酶活性，這與董冰冰研究黑麥草得出SOD是重金屬耐性敏感指標結果一致[33]。SOD對3種重金屬復合污染具有明顯的響應，這可能是因為抗氧化酶SOD最先被激活用來去除氧化自由基O-2·，其去除產物H2O2進一步被抗氧化系統中CAT、POD轉化[34]，因此黑麥草抗氧化性酶SOD對重金屬污染敏感性大于CAT和POD。

4 結論

（1）Cd、Zn、Pb復合污染下，黑麥草抗氧化酶產生了不同程度的響應。Cd表現為對CAT、POD活性的激活作用，對SOD活性的抑制作用。Zn、Pb表現為對CAT、POD活性的抑制作用，對SOD活性的激活作用。相對于3種重金屬來說，培養時間對CAT、POD、SOD活性影響顯著，特別是對POD活性的影響最大。

（2）在 Cd、Zn、Pb污染脅迫下，SOD 活性對 3種重金屬及其交互作用最敏感（P＜0.05），尤其是Cd×Zn、Zn×Pb共同作用時，因此在黑麥草抗氧化酶中可以選取SOD作為重金屬單獨或復合污染程度的指示指標。

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