富血小板血漿聯合間充質干細胞促進前交叉韌帶腱骨愈合的臨床療效研究

陳宇 徐躋峰 章水均 畢擎

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）是膝關節重要的穩定結構，一旦發生斷裂會顯著降低膝關節穩定性，不僅難以自愈，而且容易引起半月板損傷及關節退行性病變等并發癥的發生[1]。目前，ACL重建術已成為治療ACL損傷的主要方法，但肌腱移植物與骨隧道之間的愈合效果仍未得到很好解決[2]，因此，如何選取肌腱移植物是促進術后骨隧道愈合的關鍵[3]。臨床常采用單一生物材料來促進腱骨愈合，其中富血小板血漿（plate let rich plasma，PRP）是較為常用的生物材料[4]，療效雖有一定的提高，但仍不能令人滿意。部分學者開始嘗試使用間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）來促進腱骨愈合，但多數均為動物研究[5]，針對人體的療效尚不明確。筆者推測聯合使用生物材料和MSCs或許可提高腱骨愈合效果，因此，對PRP聯合MSCs促進ACL腱骨愈合的臨床療效進行了研究，旨在為臨床治療提供依據。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年6月至2016年5月本院收治的ACL損傷患者56例，按照隨機數字表法分為聯合組和單一各組28例，單一組采取單獨PRP治療，聯合組采取PRP聯合MSCs治療。納入標準：經影像學檢查確診為ACL損傷；無既往膝關節手術史。排除標準：合并嚴重疾病導致不能手術者；合并其他韌帶損傷者。聯合組男 17 例，女 11 例；年齡 27～45（35.46±9.47）歲；病程5～16（11.68±5.17）d。單一組男 15 例，女 13 例；年齡 26～47（36.11±9.87）歲；病程 7～16（12.20±4.45）d。兩組患者性別、年齡和病程等一般資料比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2 制備方法

1.2.1 自體PRP的制備 采用PRP制作包（山東威高集團醫用高分子制品股份有限公司），于無菌條件下抽取患者肘靜脈血50ml，置于FRONTIERTM5000 MULTI PRO多功能離心機[奧豪斯國際貿易（上海）有限公司]，2 000r/min離心10min，棄去下層紅細胞，取上層懸液再次離心，取下層血漿成分為PRP，將PRP與凝血酶（北京索萊寶科技有限公司，YZ-280013-97IU）按比例10∶1進行混合，形成PRP凝膠。

1.2.2 自體骨髓MSCs的制備 局部麻醉下用骨穿針抽取患者兩側骼后上棘骨髓血約80ml，置于肝素抗凝管內進行過濾，分離集合物和脂肪，置于血細胞分離機進行離心，棄去上清液、無核紅細胞層及多核細胞層，取下層濃集液作為骨髓MSCs。

1.3 治療方法

1.3.1 手術方法 將單一組制備好的肌腱移植物置于5ml PRP凝膠中浸泡30min，將聯合組制備好的肌腱移植物置于5ml PRP凝膠及5ml MSCs中分別浸泡30min。所有患者均采取ACL重建術，手術均由同一組醫師完成。蛛網膜下腔阻滯麻醉下，通過膝前內、外側入路，先行關節鏡關節探查，將脛骨端定位器定位于ACL解剖足印點中心處，極度屈膝關節至120°，制備脛骨隧道，其次通過保留的股骨外踝內側壁ACL殘端識別ACL解剖足印點，并將股骨端定位器定位于此處，制備股骨隧道。通過克氏針及引線將兩組浸泡后的移植肌腱分別經脛骨隧道引入膝關節，并拉入股骨隧道，拉緊移植肌腱脛骨端，屈伸膝關節20次左右，使肌腱順應骨隧道。拉緊脛骨端肌腱，屈膝30°，通過平頭3mm克氏針自外向內扭入可吸收擠壓螺釘，使脛骨隧道的肌腱固定。術閉，放出關節腔液體，縫合傷口。

1.3.2 治療方案 單一組于關節腔內注射PRP凝膠，在損傷關節處常規消毒并麻醉，在C型臂X線機透視下，使用注射器針頭對關節腔進行定位，確認針尖置于關節腔內后，注入制備好的5ml PRP凝膠，注射完畢后，退出穿刺針頭，使用無菌敷料覆蓋包扎。聯合組于關節腔內注射PRP凝膠聯合MSCs，在C型臂X線機透視下，先將制備好的5ml PRP凝膠注入關節腔內，再將5ml MSCs經定位針頭注入關節腔，注射完畢后，退出穿刺針頭，使用無菌敷料（上海弘生醫療科技有限公司）覆蓋包扎。

1.4 觀察指標 于術前及術后3、6、12個月對兩組患者進行MRI檢查，測量脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑，比較兩組術后脛骨隧道縮小程度。并于術前及術后3、6、12個月使用Lysholm評分、國際膝關節文獻委員會（International Knee Documentation Committee，IKDC）評分對患者膝關節功能進行評價，總分均為100分，分數越高，膝關節功能越好。

1.5 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者手術前后脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑比較 兩組術前、術后3個月脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），兩組術后3、6、12個月脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑均明顯低于術前（均P＜0.05），且術后6、12個月聯合組均明顯低于單一組（均P＜0.05），見表1。

2.2 兩組患者手術前后Lysholm評分比較 兩組術前Lysholm評分比較差異無統計學意義（P＞0.05），兩組術后3、6、12個月Lysholm評分均明顯高于術前（均P＜0.05），且聯合組均明顯高于單一組（均P＜0.05），見表2。

表1 兩組患者手術前后脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑比較（mm）

表2 兩組患者手術前后Lysholm評分比較（分）

2.3 兩組患者手術前后IKDC評分比較 兩組術前IKDC評分比較差異無統計學意義（P＞0.05），兩組術后3、6、12個月IKDC評分均明顯高于術前（均P＜0.05），且聯合組明顯高于單一組（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組患者手術前后IKDC評分比較（分）

3 討論

ACL斷裂是目前青壯年多發的運動性損傷，其原因是膝蓋穩定性降低導致活動力下降[6]，患者多出現打軟、扭傷關節疼痛等癥狀，嚴重時可發展成為骨性關節炎[7]，嚴重影響患者日常生活，因此，采取積極有效的治療措施至關重要。多數學者主張進行關節鏡下ACL重建術，通過肌腱移植物促進腱骨愈合[8]，但肌腱移植物與骨組織常存在愈合緩慢的現象，有關研究顯示，術后仍有2%～25%的患者存在腱骨愈合慢、骨隧道擴大等情況[9]。

ACL重建術后，腱骨愈合常需轉化生長因子-β（TGF-β）、血管內皮生長因子（VEGF）、血小板衍生因子（PDGF）等多種細胞因子作用[10-11]。PRP是全血中分離的血小板濃縮物，可通過血小板α-顆粒釋放大量細胞因子[12]，修復肌肉骨骼系統的損傷，促進腱-骨隧道界面瘢痕化，從而促進骨組織愈合。但PRP單獨使用時容易在關節液破壞下迅速流失[13]，使骨細胞再生能力受限，常存在術后腱骨愈合緩慢的狀況，而將PRP與凝血酶混合制成PRP凝膠，可防止血小板流失，使其長時間停留在腱骨界面釋放細胞因子，從而延長作用時間，同時PRP中含有白細胞，對防治重建術后感染具有一定意義。MSCs是存在于外周血、臍帶血及骨髓里的一種干細胞，具有多向分化潛能[14]，可在特定條件下誘導分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞等，直接促進組織生長。MSCs同樣能夠分泌多種細胞因子，促進組織快速愈合，目前已廣泛應用于軟骨修復、神經修復及燒傷創面修復等治療中[15]，但用于ACL重建術后腱骨愈合的研究較少。PRP、MSCs取材方便，且均來源于自體血液，無排斥反應，生物活性安全，減少了疾病傳播風險。

楊軍軍等[16]研究表明PRP聯合MSCs對促進兔ACL重建后腱骨愈合效果較好，在此試驗基礎下，本研究采用PRP聯合MSCs對人體進行了研究，將肌腱移植物置于制備好的PRP、MSCs中浸泡，使得在注入PRP、MSCs時肌腱移植物可充分適應PRP、MSCs環境，進而發揮最佳療效，結果顯示，兩組患者術后6和12個月脛骨隧道斜矢狀面位最大層面直徑較術前明顯縮小，且聯合組明顯低于單一組，表明PRP聯合MSCs用于ACL重建術可明顯縮小脛骨隧道，促進腱骨愈合，且療效優于單獨使用PRP，這與兩者治療方式有關，PRP、MSCs通過關節腔直接注入，可與損傷部位直接接觸，使釋放的細胞因子直接作用于腱骨界面[17]，加速腱骨愈合。此外PRP中的PDGF可以促進MSCs的分泌，加速MSCs向肌腱細胞分裂，使MSCs在骨道內大量增殖及分化[18]，加速了腱骨愈合過程。腱骨愈合的效果還可通過膝關節功能反映，Lysholm評分、IKDC評分是評價膝關節功能的標準[19-20]，得分越高表明膝關節功能越好。本研究顯示，術后兩組患者Lysholm評分、IKDC評分均明顯升高，且聯合組均明顯高于單一組，表明PRP聯合MSCs改善膝關節功能更加顯著。

綜上所述，PRP聯合MSCs可明顯加快ACL重建術后腱骨愈合，改善膝關節功能，較單一使用PRP具有顯著優勢，值得臨床推廣應用。

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