阿魏酸抑制A549肺癌移植瘤生長及其機制研究

吳競 王廷祥 魏楠 吳秀紹 劉杏娥

肺癌是全球癌癥相關死亡的首要原因[1]。盡管目前多種治療策略和抗癌藥物的使用提高了治療效果，但是肺癌患者的5年生存率仍然很低[2]。中藥被用來治療人類疾病已有幾百年的歷史。近年來，隨著聯合化療藥物的應用，中藥在腫瘤的治療中起著增強化療效果、減輕患者疼痛、延長患者生存時間等作用[3]。阿魏酸是從傘形科阿魏根莖中提取的一種中藥單體，目前已經發現其在結腸癌、肺癌和乳腺癌中具有抗腫瘤活性[4-6]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調節細胞生長、增殖和凋亡過程中起著重要的作用。腫瘤的生長與腫瘤細胞增殖、凋亡密切相關，增殖蛋白Ki-67和凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）被廣泛用來檢測腫瘤生長過程中細胞增殖凋亡的影響。但是阿魏酸是否具有抑制肺癌生長的作用及其可能的機制尚未明確。本研究擬通過用阿魏酸干預肺癌動物模型，探究阿魏酸對肺癌移植瘤的影響，為臨床治療肺癌提供新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑 阿魏酸購自上海中醫藥研究所；A549細胞購自美國ATCC細胞庫；TUNEL試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；引物購自廣州銳博生物技術有限公司；mTOR、Ki-67、Caspase-3 和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗購自美國Sigma公司；雙氧水和檸檬酸鈉抗原修復液購自杭州昊鑫生物科技股份有限公司；DAB顯色盒購自北京中杉金橋有限公司。

1.2 實驗動物 6周齡BALB/c雄性裸鼠40只，SPF級，體重約（20±3）g，購自上海史萊克實驗動物有限公司，動物合格證編號：SCXK（滬）2012-0002。本實驗研究方案通過醫院倫理委員會批準。

1.3 細胞處理 將A549細胞加入含10%FBS的DMEM培養液中，37℃、5%CO2條件下進行培養，取對數生長期細胞用于后續實驗。

1.4 裸鼠移植瘤模型構建 取對數生長期的A549細胞，配置成1×107/ml，向裸鼠右側腋窩皮下注射100μl（1×106個細胞）細胞懸液。在注射期間和注射后觀察注射部位有無包塊出現，保證無破潰區，無菌條件下飼養，建立裸鼠肺癌移植瘤模型。本研究40只裸鼠全部成瘤，成瘤率100.00%。

1.5 分組及給藥方法 采用隨機數字表法將模型裸鼠分為模型對照組、阿魏酸25mg/L組、阿魏酸50mg/L組和阿魏酸100mg/L組4組，每組10只。各組給藥方法：（1）模型對照組：腹腔注射0.2ml的 0.9%氯化鈉溶液；（2）阿魏酸25mg/L組：腹腔注射由25mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化鈉溶液配置的25mg/L阿魏酸溶液0.2ml；（3）阿魏酸50mg/L組：腹腔注射由50mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化鈉溶液配置的50mg/L阿魏酸溶液0.2ml；（4）阿魏酸 100mg/L組：腹腔注射由 100mg阿魏酸加入1L 0.9%氯化鈉溶液配置的100mg/L阿魏酸溶液0.2ml。各組每天給藥1次，連續3周。

1.6 移植瘤的處理 3周后脫臼處死裸鼠，記錄裸鼠瘤體質量、移植瘤的長徑和短徑，腫瘤體積計算方式：體積=（長徑×短徑2）/2。計算腫瘤的抑瘤率來比較各組裸鼠瘤體質量的差異性變化，抑瘤率=（1-實驗組平均瘤質量/模型對照組平均瘤質量）×100%。然后將腫瘤組織凍存于液氮中進行后續實驗。

1.7 qRT-PCR定量檢測mTOR mRNA表達水平 將移植瘤組織剪碎后加1ml Trizol提取組織總RNA，分光光度計測定RNA濃度，進行反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，在TaqDNA聚合酶催化下進行PCR擴增。以U6為內參，設計引物。mTOR上游：5′-GAACCTCAGGGCAAGATGCT-3′，下游：5′-CTGGTTTCCTCATTCCGGCT-3′。PCR 反應條件：94℃預變性 5min，95℃變性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 30s，擴增 40 個循環。采用2-ΔΔCT法進行結果分析。

1.8 Western blot法檢測 mTOR、Ki-67、Caspase-3 蛋白表達水平 將腫瘤組織剪碎后放入液氮進行研磨，加入500μl蛋白裂解液繼續研磨，離心去上清液，用蛋白定量法（BCA法）檢測蛋白濃度。取40μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結束后將其轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室溫下用5%的脫脂奶粉封閉30min，加入mTOR、Ki-67、Caspase-3一抗置于4℃孵育過夜，等滲鹽溶液加Tris-HCl緩沖液（TBST）洗膜后加入兔二抗于室溫下孵育2h，TBST洗膜后用ECL化學發光液進行化學發光反應并曝光。以GAPDH為內參照，用Quantity One軟件對條帶灰度值進行測量并分析。

1.9 免疫組化法檢測組織中mTOR、Ki-67、Caspase-3蛋白表達水平 將腫瘤組織進行固定并常規石蠟包埋，進行連續切片，切片厚度約4μm。切片脫蠟至水，用檸檬酸鈉進行抗原修復，用3%雙氧水滅活內源性氧化酶，加入 mTOR、Ki-67、Caspase-3 一抗（1：100）孵育后，加入二抗繼續孵育，用DAB溶液進行顯色，蘇木素復染后封片。視野下棕黃色顆粒為陽性結果，觀察蛋白在腫瘤組織中的表達情況。棕黃色顆粒越多，表示蛋白表達水平越高。

1.10 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。每個實驗均重復3次。

2 結果

2.1 阿魏酸對肺癌腫瘤組織生長的影響 模型對照組裸鼠移植瘤的體質量為（0.64±0.05）g；阿魏酸25mg/L組裸鼠移植瘤的體質量為（0.43±0.03）g，抑瘤率為32.82%；阿魏酸50mg/L裸鼠移植瘤的體質量為（0.36±0.04）g，抑瘤率為43.75%；阿魏酸100mg/L裸鼠移植瘤的體質量為（0.24±0.03）g，抑瘤率高達62.51%；不同劑量的阿魏酸組與模型對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖1a。另外，檢測肺癌移植瘤的體積發現，模型對照組裸鼠移植瘤體積為（0.98±0.11）cm3，不同劑量的阿魏酸組肺癌移植瘤生長也受到顯著的抑制，分別為（0.57±0.03）、（0.43±0.04）、（0.31±0.05）cm3，與模型對照組比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），呈現劑量效應關系，見圖1b。

圖1 阿魏酸抑制瘤體質量和體積（a：移植瘤體質量；b：移植瘤體積；與模型對照組相比，*P＜0.05）

2.2 阿魏酸對肺癌移植瘤組織mTOR的mRNA和蛋白表達水平的影響 與模型對照組比較，不同劑量的阿魏酸組mTOR的mRNA和蛋白表達水平均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），并具有劑量依賴性，見圖2。

圖2 阿魏酸抑制瘤體質量和體積（a：移植瘤體質量；b：移植瘤體積；c：各組肺癌移植瘤組織mTOR蛋白表達水平；與模型對照組相比，*P＜0.05）

2.3 阿魏酸對肺癌移植瘤組織中Ki-67、Caspase-3蛋白表達的影響 與模型對照組比較，不同劑量的阿魏酸組處理移植瘤后，A549細胞的Ki-67蛋白表達水平均降低（均P＜0.05），并且隨著阿魏酸的劑量升高而降低；而Caspase-3蛋白表達水平均升高（均P＜0.05），亦具有劑量依賴性，見圖3。

圖3 阿魏酸對肺癌移植瘤組織中Ki-67、Caspase-3蛋白表達的影響（a：各組肺癌移植瘤組織Ki-67和Caspase-3蛋白表達電泳圖；b：各組肺癌移植瘤組織Ki-67和Caspase-3蛋白表達水平；與模型對照組相比，*P＜0.05）

2.4 免疫組化檢測肺癌移植瘤mTOR、Ki-67和Caspase-3蛋白表達水平 免疫組化結果顯示阿魏酸能抑制移植瘤組織中mTOR蛋白表達，并隨阿魏酸劑量升高移植瘤組織中mTOR蛋白表達水平降低更明顯。免疫組化結果亦顯示阿魏酸能抑制Ki-67蛋白表達，促進Caspase-3蛋白表達升高，見圖4（插頁）。

3 討論

我國作為傳統的中醫藥大國，中草藥資源豐富且易于獲得，因此，尋找合適的中藥防治肺癌不僅有助于完善肺癌的治療方案，減少肺癌患者的病死率，提高肺癌患者近期和遠期存活率，也可以作為肺癌姑息治療中的一種選擇，對治療肺癌具有重要意義。

阿魏酸作為一種芳香族化合物，大量存在于植物的細胞壁中。阿魏酸具有抗氧化、抗微生物、抗血小板、抗炎、抗高血脂和抗癌等多種生物活性[7]。Fong等[8]報道阿魏酸能通過增加腫瘤細胞內源性活性氧生成抑制肺癌細胞的增殖和遷移。Nasr等[9]發現阿魏酸能通過抑制肺癌腫瘤細胞的粘連和遷移延緩腫瘤的進展。本研究通過檢測各組小鼠中肺癌移植瘤的體質量和體積，發現阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤的生長，并且100mg/L的阿魏酸抑瘤率高達62.51%。

已有研究報道mTOR蛋白的異常表達影響多種癌癥組織的生長和凋亡，比如肺癌、前列腺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌[10]。Jin等[11]報道抑制mTOR蛋白表達能抑制肺癌增殖并促進肺癌的凋亡。本研究中qRT-PCR、Western blot和免疫組化結果均顯示阿魏酸干預后，肺癌移植瘤組織中mTOR表達受到抑制，說明阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤組織中的mTOR表達，這可能是其發揮抑制肺癌移植瘤生長的一種機制。

Ki-67作為細胞增殖蛋白，其在腫瘤的發生、發展中有重要作用。Antonarakis等[12]研究表明Ki-67的表達增加與腫瘤的增殖和侵襲密切相關。Ji等[13]報道Ki-67的高表達與肺癌腫瘤組織的高增殖活性、低分化和早期侵襲轉移有關，并對肺癌患者的預后具有一定預測意義。Caspase-3作為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員之一，在組織細胞凋亡過程中表達水平顯著增加[14]。本研究Western blot和免疫組化結果均顯示不同劑量的阿魏酸干預后，肺癌移植瘤組織中Ki-67表達下降，Caspase-3表達升高，說明阿魏酸抑制肺癌移植瘤增殖蛋白Ki-67表達和促進凋亡蛋白Caspase-3表達，導致腫瘤增殖受到抑制并促進腫瘤凋亡。

綜上所述，本研究發現阿魏酸可以抑制肺癌移植瘤的生長，其機制可能是通過下調mTOR蛋白表達，抑制增殖蛋白Ki-67表達和促進凋亡蛋白Caspase-3表達。之后筆者將通過細胞實驗進一步探索mTOR通路在阿魏酸抑制肺癌細胞增殖中的作用。

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