選擇性雌激素受體調節劑對小鼠肥胖及脂代謝的作用

朱晶 傅曉華 張嶺 金碧輝 舒靜

代謝綜合征是一組包含肥胖、高血糖、血脂異常等一系列疾病的臨床癥候群，絕經后女性發病率顯著升高[1]。其核心是中心性肥胖和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）。研究顯示絕經后雌激素缺乏會引起能量消耗降低、脂肪氧化能力下降、體重增加及內臟脂肪堆積[2-3]。雌激素替代治療能有效改善或預防中心性肥胖和IR，降低代謝綜合征的發生率[4-5]。這提示雌激素及其受體在絕經女性脂代謝異常中扮演著重要角色。然而，長期應用雌激素會增加乳腺癌、子宮內膜癌及血栓的風險。與有完整活性的天然雌激素不同，選擇性雌激素受體調節劑（selective estrogen receptor modulators，SERMs）是指與雌激素受體高親和力結合、作用有組織選擇性特點的化合物[6]。SERMs可選擇性作用于不同組織雌激素受體，起類似雌激素或抗雌激素作用。其中他莫昔芬作為經典SERMs，目前臨床多用于雌激素受體陽性乳腺癌藥物輔助治療，但同時對骨骼、子宮及脂代謝有不同作用。近期也有研究顯示，他莫昔芬可引起脂肪組織棕色化改變[7]。本研究旨在通過建立模型觀察他莫昔芬對小鼠肥胖和脂代謝的影響，探討SERMs在絕經女性肥胖及代謝綜合征中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及模型建立 8周齡C57/BL6雌鼠32只，具有正常動情周期，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，稱重、清潔級標準飼養，飼養室溫保持在22～27℃，濕度約50%。采用隨機數字表法將小鼠分為假手術組、卵巢切除組、假手術他莫昔芬組、卵巢切除雌激素替代組4組，每組8只。各組處理方法：（1）假手術組小鼠腹腔注入0.3%戊巴比妥鈉麻醉（0.25ml/10g），打開腹腔暴露卵巢不作處理，隨即關閉腹腔；（2）卵巢切除組小鼠腹腔注入0.3%戊巴比妥鈉麻醉后行雙側卵巢切除術；（3）假手術他莫昔芬組小鼠麻醉后行假手術，術后每周1次皮下注射他莫昔芬緩釋劑0.1ml（江蘇揚子江藥業，他莫昔芬5mg碾碎，用注射級玉米油配置維持血清濃度4ng/ml）；（4）卵巢切除雌激素替代組小鼠行雙側卵巢切除術后，皮下埋植 17β-雌二醇（E2）緩釋劑（0.36mg，60d釋放，美國IRA公司）。4組小鼠手術后給予高脂飲食（40%脂肪）喂養8周，每周稱量體重和飼料消耗。

1.2 口服葡萄糖耐量試驗 高脂飲食7周后，所有小鼠禁食12h，給予20%葡萄糖溶液（0.1ml/10g）灌胃，采用血糖儀減尾試紙測定血糖（ACCU-CHEK performa，美國羅氏公司），時間依次為 0、15、30、60、90 及 120min，梯形法計算時間-血糖AUC。0～120min AUC[mmol/L·h]=[（BG0+BG15）×0.25/2]+[（BG15+BG30）×0.25/2]+[（BG30+BG60）×0.5/2]+[（BG60+BG90）×0.5/2]+[（BG90+BG120）×0.5/2]（BGx分別代表糖負荷后各時間點的血糖值）。

1.3 IR相關指標檢測 高脂飲食8周后，所有小鼠再次禁食12h，二氧化碳安樂死后心臟穿刺采血0.7～0.8ml，3 000r/min 離心 10min，分離血清-80℃保存。日立7020全自動生化分析儀檢測空腹血糖（FPG）水平，ELISA法（試劑盒購自武漢優爾生物公司）測定空腹胰島素（FINS）水平，采用穩態模型評價法計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）：HOMA-IR=（FPG×FINS）/22.5。

1.4 血清E2水平和脂代謝指標測定 采用日立7020全自動生化分析儀測定 TG、TC、HDL-C及 LDL-C，ELISA法（試劑盒均購自武漢優爾生物公司）測定血清E2和脂聯素（ADPN）水平。

1.5 脂肪組織稱重 小鼠安樂死后取皮下脂肪組織（腹股溝脂肪）及內臟脂肪組織（子宮旁脂肪）稱重記錄。分別計算各組小鼠體重增加量、皮下脂肪/體重比值及內臟脂肪/體重比值。

1.6 統計學處理 采用SPSS 24.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Sidak法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠血清AUC、FINS、FPG及HOMA-IR比較卵巢切除組小鼠AUC值最大，與其他3組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。假手術他莫昔芬組小鼠AUC值小于假手術組（P＜0.05），與卵巢切除雌激素替代組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。4組小鼠FINS和FPG水平比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。進一步計算HOMA-IR，卵巢切除組小鼠HOMA-IR值較卵巢切除雌激素替代組顯著升高（P＜0.05），其余組間比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 各組小鼠血清AUC、FINS、FPG及HOMA-IR比較

2.2 各組小鼠血清E2水平比較 與卵巢切除組和假手術他莫昔芬組比較，假手術組和卵巢切除雌激素替代組小鼠E2水平均明顯升高（均P＜0.05），見表2。

2.3 各組小鼠血清脂代謝指標水平比較 假手術他莫昔芬組小鼠血清TC、HDL-C水平均為組間最低（均P＜0.05）；其血清TG水平較卵巢切除雌激素替代組明顯上升（P＜0.05），與其余組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）；其血清LDL-C水平較假手術組及卵巢切除雌激素替代組均明顯上升（均P＜0.05），與卵巢切除組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；其血清ADPN水平較卵巢切除組顯著升高（P＜0.05），與其余組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表2 各組小鼠血清E2水平比較

表3 各組小鼠血清脂代謝指標水平比較

2.4 各組小鼠體重增加量、皮下脂肪/體重比值及內臟脂肪/體重比值比較 經過8周高脂飲食喂養后，卵巢切除組小鼠體重增加量最為顯著（均P＜0.05），假手術他莫昔芬組小鼠體重增加量最少（均P＜0.05）。進一步觀察皮下脂肪/體重比值及內臟脂肪/體重比值，卵巢切除組皮下脂肪/體重比值及內臟脂肪/體重比值增加最多（均P＜0.05），假手術他莫昔芬組皮下脂肪/體重比值及內臟脂肪/體重比值與卵巢切除雌激素替代組比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表4。

表4 各組小鼠體重增加量、皮下脂肪/體重比值及內臟脂肪/體重比值比較

3 討論

絕經后女性由于雌激素缺乏，導致中心性肥胖、IR發病率顯著上升，并進一步造成2型糖尿病、高脂血癥、高血壓等代謝綜合征的發生，且互相作用，影響老年女性健康。臨床上已經明確對絕經女性使用雌激素替代治療能有效降低中心性肥胖及IR的發生[8]。但是由于雌激素作用的泛化性及乳腺癌、血栓風險，其臨床應用一直受到限制。

SERMs是一類人工合成的化合物，具有組織選擇性特點，即可選擇性地作用于不同組織的雌激素受體，起類似雌激素或抗雌激素作用。本研究顯示，卵巢切除組小鼠和假手術他莫昔芬組小鼠在同樣的低雌激素狀態下行高脂飲食喂養，前者體重明顯升高，且皮下及內臟脂肪含量增加最多；相較之下，假手術他莫昔芬組小鼠體重增加量各組間最低，且皮下及內臟脂肪量也明顯低于卵巢切除組小鼠，與卵巢切除雌激素替代組小鼠比較差異均無統計學意義。這提示他莫昔芬雖然顯著降低循環雌激素水平，但與此同時，對于雌激素缺乏引起的體重增加及中心性肥胖有一定的改善作用，在體重控制上或許優于雌激素補充。

本研究中口服葡萄糖耐量試驗也表明，卵巢切除后小鼠在低雌激素狀態下，糖耐量明顯受損，雌激素補充治療后小鼠糖耐量改善；而假手術他莫昔芬組小鼠在低雌激素狀態下糖耐量明顯優于卵巢切除組小鼠，和卵巢切除雌激素替代組小鼠比較差異無統計學意義。該結果進一步提示：他莫昔芬或可改善雌激素缺乏引起的血糖升高及糖耐量受損，與雌激素一樣，對于絕經后2型糖尿病的發生有一定的積極作用。本研究中，去卵巢、雌激素補充及他莫昔芬干預對血清FINS水平均無明顯影響，進一步計算HOMA-IR顯示，卵巢切除雌激素替代組小鼠HOMA-IR值明顯下降，其余各組間比較差異均無統計學意義。考慮到本試驗采用穩態模型評估IR水平，對餐后階段的胰島素敏感性反應不足；若同時存在小鼠糖耐量受損胰島素分泌異常的情況，研究結果或許不夠準確。

本研究顯示假手術他莫昔芬組小鼠血清TC水平組間最低，這與Frolik等[9]既往的研究結果一致：他莫昔芬可顯著降低血清TC水平，且相較于雌激素，其對TC的抑制作用更久。對于TG、HDL-C及LDL-C各研究顯示結論并不一致。本研究顯示假手術他莫昔芬組小鼠血清HDL-C水平組間最低，與其他各組比較差異均有統計學意義；此外，與卵巢切除雌激素替代組小鼠比較，假手術他莫昔芬組小鼠血清TG和LDL-C水平上升。Markopoulos等[10]對65例絕經后乳腺癌患者使用他莫昔芬后發現，他莫昔芬顯著降低LDL-C水平，升高HDL-C水平，對TG水平無明顯影響。Atalay等[11]研究認為他莫昔芬升高血清TG水平，對HDL-C水平無明顯影響。本研究他莫昔芬顯著升高小鼠血清ADPN水平，但與卵巢切除雌激素替代組小鼠比較差異無統計學意義。Ahl等[12]研究認為循環中ADPN水平與脂肪含量成反比，且肥胖個體的ADPN水平顯著下降。本研究ADPN水平升高也進一步提示他莫昔芬在中心性肥胖及脂代謝中起重要作用。本研究由于他莫昔芬干預時間較短，樣本量較少，對研究結果會造成一定影響。

綜上所述，SERMs具有組織選擇性作用特征及抗雌激素和類雌激素的雙向作用。其在降低循環雌激素水平的同時，對于局部組織，如脂肪組織蓄積、再分布及血清脂代謝有一定的積極作用。相較于雌激素的泛作用性，在臨床上具備廣泛的應用前景。目前臨床上應用較成熟的SERMs制劑主要用于改善絕經后女性骨代謝，在脂代謝上尚在探索階段。進一步擴大樣本，探索SERMs的作用機制，為絕經女性中心性肥胖和代謝綜合征提供新的藥物研發思路是今后研究的方向。

[1]Lobo RA.Metabolic syndrome after menopause and the role of hormones[J].Maturitas,2008,60(1):10-18.doi:10.1016/j.maturitas.2008.02.008.

[2]Litwak SA,Wilson JL,Chen W,et al.Estradiol prevents fat accumulation and overcomes leptin resistance in female high-fat diet mice[J].Endocrinology,2014,155(11):4447-4460.doi:10.1210/en.2014-1342.

[3]Vieira Potter VJ,Strissel KJ,Xie C,et al.Adipose tissue inflammation and reduced insulin sensitivity in ovariectomized mice occurs in the absence of increased adiposity[J].Endocrinology,2012,153(9):4266-4277.doi:10.1210/en.2011-2006.

[4]Polotsky HN,Polotsky AJ.Metabolic implications of menopause[J].Semin Reprod Med,2010,28(5):426-434.doi:10.1055/s-0030-1262902.

[5]Babaei P,Dastras A,Tehrani BS,et al.The effect of estrogen replacement therapy on visceral fat,serum glucose,lipid profiles and apelin level in ovariectomized rats[J].J Menopausal Med,2017,23(3):182-189.doi:10.6118/jmm.2017.23.3.182.

[6]Mirkin S,Pickar JH.Selective estrogen receptor modulators(SERMs):a review of clinicaldata[J].Maturitas,2015,80(1):52-57.doi:10.1016/j.maturitas.2014.10.010.

[7]Cai J,Li B,Wang J,et al.Tamoxifen prefabricated beige adipose tissue improves fat graft survival in mice[J].Plast Reconstr Surg,2018,141(4):930-940.doi:10.1097/PRS.0000000000004220.

[8]呂玲,方素華,寧玉梅.不同雌激素制劑及方案治療絕經婦女的觀察[J].浙江醫學,2003,25(7):439-441.

[9]Frolik CA,Bryant HU,Black EC,et al.Time-dependent changes in biochemical bone markers and serum cholesterol in ovariectomized rats:effects of raloxifene HCl,tamoxifen,estrogen,and alendronate[J].Bone,1996,18(6):621-627.doi:10.1093/annonc/mdn545.

[10]Markopoulos C,Polychronis A,Dafni U,et al.Lipid changes in breast cancer patients on exemestane treatment:final results of the TEAM Greek substudy[J].Ann Oncol,2009,20(1):49-55.doi:10.1093/annonc/mdn545.

[11]Atalay G,Dirix L,Biganzoli L,et al.The effect of exemestane on serum lipid profile in postmenopausal women with metastatic breast cancer:a companion study to EORTC Trial 10951,'Randomized phase II study in first line hormonal treatment for metastatic breast cancer with exemestane or tamoxifen in postmenopausalpatients'[J].Ann Oncol,2004,15(2):211-217.

[12]Ahl S,Guenther M,Zhao S,et al.Adiponectin Levels Differentiate Metabolically Healthy vs Unhealthy Among Obese and Nonobese White Individuals[J].J Clin Endocrinol Metab,2015,100(11):4172-4180.doi:10.1210/jc.2015-2765.