早卵泡期超長方案結合選擇性單囊胚移植在體外受精中的應用

趙軍招 應映芬

趙軍招，醫學博士，教授，主任醫師，碩士研究生導師。溫州市重點創新團隊負責人，溫州醫科大學附屬第二醫院生殖中心主任。省“151”第三層次和市“551”第二層次人才。中國婦幼保健協會生育力保存委員會常務委員；省醫學會計劃生育與生殖醫學分會第六屆委員會臨床學組副組長；省人口與健康學會生殖健康專業委員會副主任委員；山東大學學報醫學版和溫州醫科大學學報審稿專家。以第一或通信作者發表論著40多篇。主持課題獲省科技進步二等獎和省醫藥衛生創新一等獎。

自1978年第1例試管嬰兒誕生以來，體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）已成為世界各國治療不孕癥的重要手段。IVF-ET治療需要借助不同的促排卵方案。目前臨床上常用的控制性超促排卵方案根據是否使用促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a） 分為GnRH-a降調節方案和非GnRH-a降調節方案。根據GnRH-a使用時間以及劑量將常見的GnRH-a降調節方案分為黃體期標準長方案、卵泡期長方案、超長方案、改良超長方案、口服避孕藥后長方案以及短方案等。非GnRH-a降調節方案主要包括自然周期方案、微刺激方案、促性腺激素釋放激素拮抗劑方案、黃體期促排卵方案、卵泡期高孕酮狀態下的超促排卵方案等。為患者制定個體化的控制性超促排卵方案，以期獲得高質量的卵子和優質胚胎，提高臨床妊娠率和活產率，降低并發癥的發生，是目前臨床工作中需解決的關鍵問題。本文著重談談早卵泡期超長方案結合選擇性單囊胚移植在體外受精中的應用。

1 早卵泡期超長方案的應用

IVF-ET治療過程中最關鍵的步驟就是控制性超促排卵，它是指通過應用外源性促排卵藥物誘發多個卵泡的發育和成熟。理想的控制性超促排卵方案應該是藥物使用劑量低、獲得卵子數目合理、卵子質量較高、超促排卵過程中及促排后內分泌環境及子宮內膜條件均適合胚胎的著床和發育、促排的周期取消率和不良反應如卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyper stimularion syndrome，OHSS）發生率低、可以精確地調控整個控制性超促排卵的過程。

1.1 早卵泡期超長方案在子宮內膜異位癥患者中的應用 子宮內膜異位癥是女性不孕患者的重要病因之一。在IVF-ET中，針對子宮內膜異位癥合并不孕患者的治療方案是以GnRH-a為主的超長降調節方案，但其治療效果并不十分理想。超長降調節方案通過抑制黃體晚期內源性LH峰上升，促進卵泡發育的同步化，并且可通過提高子宮內膜容受性和降低盆腔中對胚胎產生毒性反應的細胞因子濃度，改善盆腔內環境而有利于胚胎的著床。但是超長降調節方案有一個很明顯的不良反應，即2～3個月的垂體脫敏狀態，使得卵巢功能壓制過深。在多次GnRH-a針的降調節后再進行促性腺激素（Gonadotropin，Gn）超促排卵時發現卵巢功能壓制較深，使得臨床需要更大量的Gn啟動量和Gn總量，甚至增加周期取消率，這在很大程度上增加了患者的時間以及經濟成本。

Becchetti等[1]研究顯示GnRH-a可增加子宮內膜胞飲突的數量，增強整合素的表達，從而提高子宮內膜容受性；同時可降低盆腔中對胚胎產生毒性反應的IL和TNF濃度，改善盆腔內環境，從而有利于胚胎的著床。改良超長方案可以明顯提高子宮內膜異位癥患者的臨床妊娠率。改良超長方案因其在改善子宮內膜容受性及增加卵泡和內膜發育的同步性等方面的作用，日漸受到生殖一線臨床醫師的關注。

改良超長方案的使用方法也不盡相同：有口服避孕藥一定時間后注射一定劑量的長效GnRH-a，有注射一次一定劑量的長效GnRH-a后再次注射一定劑量的長效GnRH-a，有上一周期的黃體中期進行一次全量長效GnRH-a等。這些方案與傳統黃體期標準長方案相比，體現了改良超長方案在垂體脫敏狀態的適宜程度和在內膜移植環境的優化。鑒于口服避孕藥后注射GnRH-a或者2次注射GnRH-a仍然需要耗費患者較多的時間成本，本中心經過借鑒實踐，通過患者來月經1～3d進行一次全量長效劑量GnRH-a 3.75mg的注射，32～38d后根據卵泡大小和血清中激素水平確定啟動促排時間——這種卵泡期超長方案在達到適宜的垂體降調節狀態的前提下，時間成本大大縮短，患者注射針劑次數大大減少，優化移植環境，最大程度縮短患者的達活產時間，從而最終提高患者的就診效率和滿意度。

Broekmans等[2]研究表明正常育齡婦女無論是在早卵泡期還是黃體中期單次注射長效GnRH-a 3.75mg后2周內源性激素可達完全抑制水平，3～4周后促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平逐漸恢復，7～8 周后雌激素（Estradiol，E2）水平開始上升，LH 水平的抑制作用可持續至給藥8周。國內伍瓊芳研究團隊在早卵泡期超長方案的應用證實，在早卵泡期單次給予全量GnRH-a行垂體降調節，30d后隨著體內FSH水平的逐漸恢復開始啟動超促排卵，而LH的持續抑制作用可以避免內源性LH峰的產生[3]。本中心在早卵泡期超長方案的不斷探索和推廣應用的實踐效果提示，早卵泡期超長方案給予一次全量長效GnRH-a 3.75m后的32～38d后，根據竇卵泡的蘇醒情況以及性激素的水平，進行實時啟動，并沒有增加患者的Gn超促排卵的時間和用量，并且能夠優化胚胎移植環境，提高患者的持續臨床妊娠率和抱嬰回家率。

1.2 早卵泡期超長方案在輸卵管積水患者中的應用療效 IVF-ET是主要針對輸卵管疾病患者開展的助孕技術。據本中心統計，因輸卵管因素接受IVF-ET助孕的婦女中，有20%存在B超下可視的輸卵管積水。Johnson等[4]研究都證實了輸卵管積水對助孕結局的負面影響，包括積水對胚胎的機械性沖刷、積水內的炎性介質對胚胎的毒性反應以及降低子宮內膜對胚胎的容受性等。有研究報道輸卵管積水還可降低子宮內膜著床因子的水平；低滲、低K+、低乳酸、低蛋白溶液的積水對胚胎發育不利，會對IVF-ET的臨床結局產生不同的影響[5-7]。

究其輸卵管積水的實質，與上面提到的子宮內膜異位癥其實是相類似的，都是產生一定的炎性介質影響試管嬰兒結局。輸卵管積水患者應用早卵泡期超長方案，可以讓卵巢功能休息1個月左右時間，從而大大改善盆腔內環境，為新鮮胚胎的種植帶來最小的炎性盆腔環境的干擾。當然，如果在降調節1個月左右患者進行啟動后仍然在陰道B超下看到較為明顯的輸卵管積水，可予以適當抗生素預防；在超促排卵啟動前或取卵日進行輸卵管積水的超聲引導下穿刺。實踐提示早卵泡期超長方案同樣適用于輸卵管積水患者，并且可以取得理想的IVF-ET結局。

1.3 早卵泡期超長方案在卵巢儲備功能低下患者的應用 近年來接受IVF-ET治療的高齡婦女逐漸增加，38歲以上者占到30%以上。高齡患者的卵巢儲備功能下降尤為明顯，少部分年輕患者也存在卵巢儲備功能下降的現象。即使進行試管嬰兒助孕，這些患者的成功率也并不高。針對卵巢儲備功能下降，臨床醫師更多傾向選擇微刺激方案、短方案、超短方案、自然周期等方案。微刺激方案由于沒有垂體降調節過程，很容易出現早發的LH峰，提前排卵取不到卵的情況時有發生，這給患者帶來極大的精神壓力。自然周期雖然是通過卵泡自然生長規律監測，但是取卵時間不容易掌控。

那么，如何改善卵巢儲備功能低下婦女的助孕結局呢？首先，正確評估高齡婦女的卵巢儲備功能，選擇合適的促排卵方案，獲得一定數量的卵子是實施IVFET治療的必要前提。對于高齡患者，特別是40歲以上的患者，目前臨床上還沒有一種理想的超促排卵方案。羅克莉等[8]認為卵巢儲備功能低下患者采用改良超長方案可以取得較好的臨床結局。改良超長方案經過GnRH-a的預處理，使患者充分降調節，扳機日可以獲得良好的LH、孕酮、E2值及內膜厚度，從而提高子宮內膜容受性[9]。

本中心通過早卵泡期超長方案的應用，38～42歲的雙側卵巢竇卵泡數在5個以上的患者臨床妊娠率高達45%；36歲及以下卵巢儲備功能下降的患者臨床妊娠率達到60%。說明早卵泡期超長方案同樣適用于卵巢功能下降患者，并且臨床結局甚佳。

1.4 早卵泡期超長方案在多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患者中的應用 PCOS是一種生殖內分泌紊亂疾病，這一特殊人群采用何種促排卵方案一直存在爭議，國內大多數生殖中心采用的是傳統長效長方案，認為該方案有助于PCOS患者獲得較高質量的卵子和提高助孕成功率。另外，也有在長效長方案之前給予PCOS患者口服避孕藥數個月的預處理，目的在于糾正此類患者LH/FSH比列異常、高雄激素血癥等病理情況[10]。國外生殖中心大多選擇拮抗劑方案，因其可以有效降低卵巢過度刺激風險的發生。

早卵泡期超長方案在應用全量長效GnRH-a后，無需進行傳統長方案之前的口服避孕藥的預處理，通過單次全量長效GnRH-a的注射，使得卵巢功能充分休息，對于LH/FSH比列異常升高的患者也可以在降調節1個月左右的時間后達到理想的垂體脫敏狀態，更好地控制了患者Gn啟動前LH水平。此外，通過垂體充分降調節，更好地控制了扳機日孕酮水平及孕酮/E2水平，改善了內膜的容受性。Orvieto等[11]研究顯示扳機日A、B型子宮內膜更易于胚胎的著床和發育，而C型子宮內膜的著床率明顯降低；改良超長方案患者扳機日A、B型子宮內膜形態更高。

本中心在PCOS患者應用早卵泡期超長方案后，同樣使得新鮮胚胎移植的子宮內膜環境改善，增加了胚胎的著床率，提高了此類患者的成功率。

2 選擇性單囊胚移植的推進

輔助生殖技術在國內成功應用30年，IVF-ET妊娠率在逐年上升，甚至一些大型生殖中心的成功率達到國際先進水平。成功率不斷提升的同時，筆者也將更多的關注點投向IVF-ET的安全性。IVF-ET的終極目標是采用盡量少的時間和經濟成本使患者獲得單個健康活嬰的出生。傳統的移植策略往往導致多胎妊娠及OHSS等并發癥發生率居高不下，致使孕產婦、胎兒相關并發癥（妊娠期高血壓、早產、低體重新生兒等）不斷出現。隨著囊胚培養技術的不斷提高，越來越多的研究發現囊胚移植可以達到更高的胚胎種植率，尤其是選擇性單囊胚移植策略可以提高患者的累積妊娠率，顯著降低多胎妊娠率，有效降低中重度OHSS的發生率以及異位妊娠率，由此選擇性單囊胚移植的理念應運而生[12-13]。Mullin等[14]研究表明，選擇性單囊胚移植與雙囊胚移植比較并沒有降低每個取卵周期的累積妊娠率，但能避免多胎的發生，顯著減少輔助生殖治療的多胎妊娠率。

在常規IVF-ET治療中，一般在胚胎受精后第2天或第3天移植。目前評價早期胚胎的形態學標準仍然存在著較多的主觀因素，對胚胎的后期發育潛力難以作出準確的判斷。隨著囊胚體外培養技術的提升，許多研究發現早期胚胎的種植率和臨床妊娠率并沒有囊胚的高[15-17]，因為早期胚胎對內膜種植窗的要求高，無論是新鮮周期還是冷凍周期，都需要子宮內膜和早期胚胎高度的同步化才能收獲好的臨床結局。但是IVF-ET由于各種超促排卵方案的不同，尤其是促排后期隨著卵泡進一步走向成熟，體內E2水平的上升，LH和孕酮水平很多時候也出現了提早升高，使得胚胎種植窗提前打開，如果仍然選擇移植早期胚胎往往使得內膜和胚胎不同步而導致胚胎種植失敗，降低胚胎的種植率，而囊胚的種植率則不受影響[18]。

早期胚胎從四細胞、八細胞發育至囊胚期具有阻滯現象，逾越八細胞期的發育阻滯就成為了具有生命力的胚胎。只有具備良好發育潛能的早期胚胎才能發育到囊胚期[19]。所以早期胚胎在體外培養至囊胚的過程中，將會自然淘汰發育潛能差的胚胎，那些生存能力強、質量好的胚胎，具有更大發育潛能的胚胎經過優勝劣汰的大自然法則而存留下來。囊胚移植時子宮腔內pH值較輸卵管內低，囊胚對酸度的適應能力較早期胚胎好，可以提高囊胚的存活率；囊胚與子宮內膜同步性更好，更符合生殖生理狀態，因子宮的收縮而排出體外的風險降低，增加囊胚種植率。

雖然選擇性單囊胚移植具有顯著的優點，但是并未在國內廣泛應用開展。究其原因，和患者的接受度、IVF-ET的經濟負擔、囊胚體外培養時間增加影響胚胎安全性等因素有關，仍然需要做出更多相關努力。

3 早卵泡期超長方案結合選擇性單囊胚移植

GnRH-a除可通過垂體水平發揮其降調節作用外，還可直接與卵巢顆粒細胞的特異位點結合，抑制卵巢內E2和睪酮等類固醇激素的分泌，降低其在卵泡液中的水平。Botero-Ruiz等[20]研究顯示卵母細胞的成熟與受精能力與卵泡液內的E2及睪酮水平呈負相關。早卵泡期超長降調節方案可以通過改善卵泡發育同步性及調節卵泡液中與卵子發育及受精潛能高相關的類固醇激素和細胞因子的分泌來改善卵子的質量。上述利好因素之下，早卵泡期超長方案聯合選擇性單囊胚移植周期臨床妊娠率較傳統的黃體期長方案明顯升高，本中心的數據也證實了這點。

垂體在全量長效GnRH-a 3.75mg降調節后可以有效維持垂體脫敏狀態至降調節后8周，這段時間內需要尋找最佳的啟動時間，言外之意需要準確判斷卵巢內小竇卵泡蘇醒情況。如果大部分卵泡在降調節30+d后回訪進行卵泡監測提示雙側卵泡細小，即雙側卵巢內小竇卵泡的直徑在3mm以內時，筆者認為此時啟動需要耗費額外的Gn，同時體內E2水平未達到30pg/ml，更加證明小竇卵泡還沒有完全蘇醒，需要適當推遲啟動時機；如果全量長效GnRH-a 1月余后雙側卵巢內已經有一批小竇卵泡的直徑達到5mm，體內E2水平達到30pg/ml時，說明小竇卵泡即將蘇醒，此時也正是很好的啟動時機。

總體來講，早卵泡期超長方案選擇全量長效GnRH-a后32～38d評估患者的垂體脫敏狀態并進行適時啟動，并沒有顯示Gn劑量和Gn時間較傳統的黃體期長方案顯著增加，并不會顯著增加患者的時間和經濟成本。隨著細胞培養技術日益進步，囊胚移植周期比例在不斷增加，本中心已經成熟開展了“全胚養囊”策略，較高的囊胚形成比率、可利用囊胚比率以及優質囊胚比率極大地改善了患者的臨床妊娠結局，最大限度地縮短了患者的治療周期，實現了患者盡快抱嬰回家的愿望。選擇性單囊胚移植在保證臨床妊娠率的同時，明顯降低了多胎率、晚期流產率、早產率及低體重兒出生率等不良妊娠結局的發生；可作為一種優先考慮的臨床移植策略，結合早卵泡期超長方案對胚胎移植環境的改善，兩者的結合體現出了較高的性價比。

綜上所述，早卵泡期超長方案不僅僅可以在子宮內膜異位癥、輸卵管積水、卵巢儲備功能低下、PCOS等患者中有其用武之地，而且臨床結局令人鼓舞。早卵泡期超長方案聯合選擇性單囊胚移植是一種非常值得推廣應用的試管嬰兒助孕方案，值得進一步大規模前瞻性臨床研究進一步證實。

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