沉默信息調節因子1對早期2型糖尿病大鼠脂聯素的調節作用

唐正和，康懷蘭，劉翠明

(山東萊蕪鋼鐵集團有限公司醫院內分泌科，萊蕪 271126)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組因遺傳和環境因素相互作用引起的臨床綜合征，而2型DM合并存在胰島素抵抗和脂代謝障礙。DM狀態下，炎癥反應、自由基產生和脂質過氧化均可破壞肝細胞結構及功能，在肝病的發生發展過程中起重要的作用[1]。脂聯素(adiponectin，APN)是脂肪組織中最豐富的基因產物之一，可加強胰島素抑制糖異生作用并抑制肝糖原的生成，具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用，在機體脂質代謝、血糖穩態調控和血管生理作用中具有重要地位[2]。脂聯素受體(adiponectin receptor，AdipoR)是介導APN生物學作用的關鍵蛋白，而肝臟是AdipoR2高表達器官。大量的研究證實[3]，肥胖、胰島素抵抗、2型DM患者血清APN水平顯著變化，且與AdipoR2在靶器官的表達水平具有相關性。Wnt誘導分泌蛋白-1(Wnt-induced secreted protein-1，WISP-1)是Wnt信號通路活化后的下游靶基因之一[4]，參與器官損傷修復，以及心、肺、肝等臟器纖維化的發生[5]，而DM肝損傷是否與WISP-1有關，報道較少。沉默信息調節因子1(silent information regulator 1，SIRT1)可通過參與APN蛋白相關的多個細胞信號通路的表達調控而參與糖脂代謝[6]。本實驗通過觀察DM大鼠APN分泌與Wnt信號通路下游靶基因WISP-1在肝損傷組織中的表達，分析DM肝損傷發生的病理生理機制，并探討SIRT1對APN分泌的調控作用。

1　材料與方法

1.1　實驗材料

鏈脲菌素、SIRT1激動劑白藜蘆醇(resveratrol，RES)、SIRT1抑制劑尼克酰胺(niacin amide，NIA)(上海國藥試劑集團)；血糖試紙(強生中國醫療器材有限公司)；生物素標記山羊抗兔IgG/小鼠IgG二抗試劑盒(北京中杉金橋生物)；TRIzol試劑盒(Roche，德國)。單克隆抗體：AdipoR(Cell Signaling Technology公司，美國)，WISP-1(Sigma公司，美國)，SIRT1(LifeSpan，美國)，β-actin(Ambobio，美國)。7300型實時聚合酶鏈式反應儀(Applied Biosystems，德國)。

健康雄性Sprague-Dawley大鼠，SPF級，體質量150～180 g，50只[由山東省醫學科學院動物中心提供，合格證號：SCXK(魯)2016-0121]。適應性喂養1周后，隨機分為2組：對照組10只和DM造模組40只。DM造模組采用高脂飲食(豬油30.0%，膽固醇2.5%，脫氧膽酸鈉1.0%，常規飼料66.5%)灌胃，并于5周末禁食12 h后，一次性腹腔注射1%鏈脲菌素(30 mg/kg，pH=4.5的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液)；正常對照組飼以普通飲食，注射同體積檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。造模后72 h尾靜脈采血，血糖試紙檢測空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)。以FBG≥11.1 mmol/L，并出現多飲、多食、多尿和體質量下降者為DM大鼠模型成功。DM造模成功大鼠隨機分為3組：DM組、DM+RES組和DM+NIA組，各組繼續以高脂飲食灌胃4周，4周后DM+RES組和DM+NIA組分別每日再給予RES和NIA，持續4周。對照組繼續以普通飼料喂養8周。

1.2　方法

1.2.1胰島素敏感指數及肝損傷指標檢測DM造模組大鼠分別于8周末禁食12 h，頸靜脈竇取血，離心分離血清，檢測FBG及空腹胰島素(fasting insulin，FINS)水平，計算胰島素敏感指數(insulin sensitivity index，ISI)，公式為：ISI=ln[1/(FINS×FBG)]；同時檢測天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate amino transferase，AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine amino transferase，ALT)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)等肝血清酶學指標。

1.2.2標本收集造模結束后，麻醉大鼠，仰位固定，開胸，腹主動脈取血，5 ml/只，3000轉/ min離心10 min，取上清，分裝，-20℃保存待測。生化儀檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒檢測APN水平。迅速取出肝臟，用預冷生理鹽水洗凈，取肝右葉分為兩部分：一部分用4%多聚甲醛固定，制成肝臟組織石蠟塊；另一部分置于液氮中保存待用。

1.2.3HE染色取石蠟切片常規脫蠟，蘇木素染色10 min，流水稍洗，1%的鹽酸乙醇分化，流水沖洗數分鐘，伊紅染色5 min，流水稍洗，梯度乙醇常規脫水，中性樹膠封片。Eclipse TE 2000-S免疫熒光顯微鏡拍照(Nikon，日本)，觀察肝臟組織病理結構的改變。

在聽覺上，民族唱法的音色亮多暗少，而美聲的音色則相對較暗。在聲音位置上，兩種唱法也有不同之處，民族唱法高音轉為腦后音，不豎上頭頂，而美聲唱法要求高音必須豎在頭頂。

1.2.4Western bloting實驗每20 mg組織加入100～200 μl含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fuoride，PMSF)的裂解液，研磨充分后，4℃下 14 000g離心10 min，取勻漿上清，并測定總蛋白濃度。總蛋白(40～70 μg上樣量)于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)進行分離。濕法轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后，與相應一抗4℃共孵育過夜。次日與辣根過氧化物標記的二抗共孵育，用增強型化學發光試劑進行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析。

1.2.5逆轉錄-聚合酶鏈式反應將肝組織均勻粉碎后按TRIzol提取程序(說明書)提取組織總RNA；按鳥類成髓細胞白血病病毒(avian myeloblastic leukemia virus，AMV)逆轉錄試劑盒操作說明進行逆轉錄后，4℃保存。各目的基因的擴增引物序列，如表1所示。擴增條件：94℃預變性3 min，然后94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共 35個循環，最后72℃延伸5 min，快速冷卻至4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀察，用Band Scan 5.0軟件測定條帶灰度值。

1.3　統計學處理

2　結　果

2.1　大鼠DM模型建立情況

DM造模組有5只大鼠造模后血糖檢測值未達到標準，3只大鼠死亡，均剔除。DM組造模成功大鼠共32只，成功率為80%。隨機分到DM組、DM+RES組及DM+NIA組分別10、11和11只。

實驗期間，正常對照組大鼠狀態良好、健壯、自主活動正常。而DM造模組大鼠逐漸出現精神萎靡、腥臊臭味加重，以及多飲、多食、多尿、體質量降低等DM癥狀。與正常對照組相比，DM造模組大鼠進食量[(33.41±4.29)vs(42.71±6.16)g/d]、飲水量[(54.01±8.77)vs(89.30±11.11)ml/d]和尿量[(7.88±3.17)vs(75.81±8.79)ml/d]均顯著增高(P<0.05)。檢測血糖相關指標，結果表明，與對照組比較，DM造模組大鼠血清FBG[(5.00±0.17)vs(32.30±3.11)mmol/L]和FINS[(21.27±0.62)vs(28.76±0.95)mU/L]顯著升高(P<0.05)，而ISI[(-4.67±0.45)vs(-6.83±0.70)]顯著下降(P<0.01)，表明2型DM大鼠造模成功。

2.2　4組大鼠血生化指標檢測

與正常對照組比較，DM組大鼠血清FBG、TG、TC和LDL-C水平顯著增高，而HDL-C水平顯著降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。與DM組相比較，FBG在DM+RES組顯著降低(P<0.05)，在DM+NIA組略有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)；TC和LDL-C在DM+RES組顯著降低(P<0.01)，在DM+NIA組顯著升高(P<0.05)；TG在DM+RES組顯著降低(P<0.05)；HDL-C在DM+RES組顯著升高(P<0.01；表2)。

2.3　4組大鼠肝損傷指標及血清APN水平檢測

血清肝功能指標檢測發現，DM組大鼠在造模8周后并發肝臟損傷，血清肝功能指標 ALT、AST、ALP及AST/ALT值均顯著高于對照組(P<0.01)。與DM組相比較，DM+RES組的AST、ALP及AST/ALT值均顯著下降(P<0.05)，ALT也有所下降，但差異不具有統計學意義(P>0.05)，顯示肝損傷得到一定程度的改善；DM+NIA組的ALT、ALP及AST/ALT值繼續顯著升高(P<0.05；表3)，顯示肝損傷嚴重程度可能進一步加大。與對照組相比，血清APN在DM組顯著降低(P<0.01)；與DM組相比較，DM+RES組的APN水平略有升高，但差異無統計學意義(P>0.05)，DM+NIA組血清APN水平顯著降低(P<0.05；表3)。

表1　定量逆轉錄-聚合酶鏈反應引物序列

WISP-1: Wnt-induced secreted protein-1; AdipoR: adiponectin receptor; SIRT1: silent information regulator 1

2.4　光鏡檢查結果

與正常對照組大鼠相比較，DM組大鼠肝臟肝小葉結構紊亂，出現脂肪變性，肝細胞出現腫脹，胞漿出現空泡化；DM+RES組大鼠肝臟脂肪變性減輕，炎細胞浸潤及點狀壞死亦減輕，細胞質疏松化較輕；DM+NIA組大鼠肝臟細胞核被擠向細胞邊緣，肝細胞散在小泡性脂滴，肝竇不清晰，肝索排列紊亂，肝細胞腫脹程度更高(圖1)。

2.5　4組大鼠AdipoR2、WISP-1和SIRT1表達變化

Western blotting實驗結果表明，相對于正常對照組，DM組大鼠肝臟AdipoR2和SIRT1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，WISP-1蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與DM組相比較，DM+RES組AdipoR2和SIRT1蛋白表達顯著增加(P<0.05)，WISP-1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而DM+NIA組AdipoR2和SIRT1蛋白表達顯著降低(P<0.05)，WISP-1蛋白表達具有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05；圖2)。

DM大鼠各組與正常對照組大鼠肝臟組織AdipoR2、WISP-1及SIRT1 mRNA的表達均表現出差異，表達趨勢與蛋白表達基本一致。與對照組比較，AdipoR2和SIRT1 mRNA在DM組大鼠中表達顯著降低(P<0.01)，WISP-1蛋白表達顯著升高(P<0.01)；與DM組比較，AdipoR2和SIRT1 mRNA在DM+RES組表達顯著增加(P<0.01)，WISP-1 mRNA表達顯著降低(P<0.01)；而DM+NIA組AdipoR2表達顯著降低(P<0.05)，WISP-1 mRNA表達具有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，SIRT1 mRNA表達有升高趨勢，差異無統計學意義(P>0.05；圖3)。

3　討　論

APN是脂肪組織表達最豐富的基因產物之一，具有改善胰島素敏感性的作用，在機體脂質代謝和血糖穩態調控中具有重要作用[7]。APN作為體內最重要的脂源性激素之一，在肝臟組織糖和脂肪代謝中起關鍵性作用[8,9]。AdipoR作為APN的特異性受體，在多種組織中廣泛分布，直接決定了APN效應的發揮。AdipoR1和AdipoR2在肝臟組織中均有表達，但存在差異性。AdipoR2在肝細胞的高表達，確保了APN可以準確有效地通過不同的受體形式發揮其反饋調節或改善糖脂代謝的作用[10]。研究表明[11]，有DM家族史而糖耐量正常的個體其肝組織AdipoR2的表達水平與DM病情具有相關性。WISP-1是Wnt通路的下游因子，當其在細胞質或細胞核內異常積聚就會啟動相應的基因轉錄，最終抑制細胞凋亡，促進細胞增殖。研究顯示[12]，作為Wnt通路下游的因子，WISP-1的表達受Wnt/β-catenin的調控。SIRT1參與DM多種并發癥的發生發展，可能是重要的調控因子。Wang等[4]研究顯示，SIRT1能夠通過調控WISP-1的表達來參與DM心肌病的發生發展過程，但在DM肝損傷中的研究卻未見報道。

表2　4組大鼠血生化指標比較

FBG: fasting blood glucose; TC: total cholesterol; TG: triglycerides; HDL-C: high-density lipoprotein cholesterol; LDL-C: low-density lipoprotein cholesterol. Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01; compared with DM group,#P<0.05,##P<0.01

表3　4組大鼠肝損傷指標及血清APN水平比較

AST: aspartate amino transferase; ALT: alanine amino transferase; ALP: alkaline phosphatase; APN: adiponectin. Compared with control group,**P<0.01; compared with DM group,#P<0.05,##P<0.01

本實驗研究DM狀態下，大鼠模型肝組織的病理生理變化與APN和WISP-1蛋白表達之間關系。研究顯示，在經過驗證的DM大鼠模型中，可見肝組織大量炎細胞浸潤、變性及壞死，模型組APN水平降低，AdipoR2表達降低，WISP-1蛋白表達顯著升高；而當給予SIRT1特異性激動劑RES處理后，SIRT1蛋白表達顯著增加，APN水平升高，伴隨著AdipoR2表達也升高，WISP-1蛋白表達則降低。分析原因可能是由于SIRT1表達被激動后，Wnt/β-catenin信號通路受到抑制，導致下游WISP-1蛋白表達增加，WISP-1水平增高抑制了APN抵抗，而不斷緩解胰島素抵抗和所謂的“APN抵抗”相互影響，使APN促胰島素敏感性的作用不斷增強，形成肝損傷不斷緩解的良性循環。本實驗的肝組織病理學檢查結果表明，DM+RES組表現出炎細胞浸潤及壞死程度的減輕，也印證了這一點推斷。而在DM+NIA組，WISP-1表達升高，APN水平和AdipoR2表達降低，也反向印證了我們的推斷。

圖3　AdipoR2、WISP-1及SIRT1 mRNA在各組中的表達

AdipoR: adiponectin receptor; WISP-1: Wnt-induced secreted protein-1;SIRT1: silent information regulator 1. Compared with control group,**P<0.01; compared with DM group,#P<0.05,##P<0.01

DM肝損傷是DM的嚴重并發癥，內分泌改變在該病的發生發展過程中起重要作用。本研究證實了在早期DM肝損傷的發生發展過程中，SIRT1信號分子可能通過調節AdipoR的表達來調控APN的水平，參與DM內分泌系統的病理生理演變，進一步明確APN在DM肝損傷發生發展過程中可能的機制及SIRT1因子在該機制中可能的調節作用，為進一步闡明DM肝損傷的發生機制和尋找治療靶點提供了參考。

【參考文獻】