UPLC-MS/MS法檢測唾液中的奧沙西泮

吳東星，李樹華，李繼印，任國印，曾思火，李 虹

隨著濫用藥物逐漸成為世界性的社會問題，體內濫用藥物分析向法庭科學領域、毒物分析領域提出了新的任務和要求。目前，國內對濫用藥物檢測的方法有：氣相色譜—質譜聯用(gas chromatography/mass spectrometry,GC/MS)法[2-4]、高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法[5-8]和超高效液相色譜—串聯質譜(ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法[9-13]，多用以檢測人體血液、尿液，而對唾液檢測的文獻報道較少。因此，本研究用UPLC-MS/MS法對人體唾液中奧沙西泮(oxazepam)進行了檢測，現報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器超高效液相色譜—串聯質譜聯用儀：AgiLent1290型超高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，德國)和AB SCIEX 4000Q TRAP 串聯質譜儀(AB SCIEX公司，新加坡)，配Analyst? software工作站；AllegraTM X-22臺式高速離心機(貝克曼庫爾特公司，美國)。

1.2標準品與試劑奧沙西泮購自公安部物證鑒定中心，純度≥98%；乙腈、甲醇試劑為色譜純，甲酸、氨水試劑為分析純，實驗用水為去離子水。

1.3實驗樣品65份唾液樣品均采自口服奧沙西泮1片(每片15 mg)后30 min 至12 h的5名志愿者。

1.4色譜條件ACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)；流動相0.1%甲酸水溶液—乙腈梯度洗脫，洗脫程序見圖1；進樣體積5 μL，流速0.4 mL·min-1，運行時間6 min，柱溫35 ℃。

1.5質譜條件采用電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI)，分析物在正離子掃描下檢測；三重四極桿檢測器；毛細管電壓為5.5 kV；去溶劑氣溫度550 ℃，去溶劑氣流量：800 L·h-1；錐孔氣流量30 L·h-1；碰撞氣流量：0.15 mL·min-1，錐孔電壓80/12，碰撞電壓30/13。奧沙西泮的監測離子為287.0/241.0、287.0/165.0和287.0/104.0。

1.6樣品前處理用甲醇稀釋唾液至一定倍數，經振蕩器振蕩3 min，在15 000 r·min-1轉速下離心3 min，取上清液過有機濾膜(13 mm×0.22 μm)后供檢。

1.7標準工作液的配制精密稱量10.0 mg奧沙西泮標準品于10 mL容量瓶內，用甲醇稀釋至刻度線，振搖均勻得到1.0 mg·mL-1奧沙西泮標準液，置4 ℃冰箱保存。取空白唾液，按1.6節方法處理后，取適量上清液按濃度梯度逐次稀釋1.0 mg·mL-1奧沙西泮標準液成濃度分別為100、50、20、10、5和1 ng·mL-1的線性工作溶液，置4 ℃冰箱保存、待測。

2 結果

2.1系統適應性試驗在1.4和1.5分析條件下，分別對空白對照、質控樣品(10 ng·mL-1)和唾液樣品檢測，以287.0/241.0、287.0/165.0和287.0/104.0這3對離子對和保留時間(Rt=2.24 min)進行定性分析，并與已知奧沙西泮標準物質進行比對，空白對照無干擾。進樣結果表明：UPLC-MS/MS檢測方法專屬性好，見圖1。

圖1 不同樣品中奧沙西泮的定量離子對色譜圖

2.2流動相的考察本文分別用流動相為0.1%甲酸的乙腈溶液-0.1%氨水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液對質控樣品進行梯度洗脫，進樣結果表明：奧沙西泮在流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液中響應度較高。因此，本文選用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

2.3提取溶劑的考察本文分別用乙腈、甲醇試劑對唾液樣品進行前處理，經UPLC-MS/MS檢測分析表明：用甲醇作為提取溶劑時，奧沙西泮具有良好的色譜峰。

2.4線性范圍、檢出限和定量限取濃度分別為1、5、10、20、50和100 ng·mL-1的奧沙西泮標準溶液，在1.4和1.5節條件下測定；以定量離子(287.0/241.0)峰面積A為縱坐標，質量濃度C為橫坐標，繪制奧沙西泮的標準曲線，求得標準曲線的回歸方程和相關系數。以線性最低點溶液逐倍稀釋后，以信噪比>3為檢出限，以信噪比>10為定量限。奧沙西泮的線性方程、檢出限和定量限見表1。

表1 奧沙西泮的線性方程、檢出限和定量限 ng·mL-1

2.5回收率、基質效應和精密度分別配制5、50、90 ng·mL-1奧沙西泮標準溶液各6份，按1.6節方法處理后，在1.4和1.5節條件下測定，每日進樣5次，每次間隔2 h，記錄峰面積As，計算日內精密度(relative standard deviation,RSD)表示；每份樣分別連續測定3 d，計算日間精密度用相對標準偏差。取空白唾液18份，分別加入濃度為5、50、90 ng·mL-1的奧沙西泮標準溶液1 mL，配置成實際添加含量分別5、50、90 ng的空白添加系列樣本為各6份，按1.6節方法處理后，在1.4和1.5節條件下測定，記錄峰面積為Am。將所測得的Am數據代入奧沙西泮標準曲線方程，并計算測得值，以測得值與實際添加量對比，計算提取回收率。另取上述3個濃度的標準溶液，在1.4和1.5節條件下直接進樣測定，記錄峰面積為Astd，以Am/Astd計算基質效應，結果見表2。

表2 奧沙西泮的回收率、基質效應、準確度、精密度和穩定性

注：RSD：相對標準偏差。

2.6穩定性配制低、中、高3個濃度的質控樣品(n=3)，于室溫放置24 h及經過3次凍融循環后，按1.6節方法處理質控樣品濃度為5、50、90 ng·mL-1的溶液，并在1.4和1.5節條件下測定，考察其短期穩定性及凍融穩定性。結果表明，奧沙西泮在上述條件下均穩定(見表4)。

2.7樣品測定采集5位志愿者的65份唾液，按1.4節方法處理后，在1.4和1.5節條件下測定。65份唾液中，全部檢出奧沙西泮，其中定量數為57份，8份只能定性，結果見表3。

3 討論

本研究建立了唾液中奧沙西泮的UPLC-MS/MS的檢測方法。實驗結果表明：唾液樣品經甲醇蛋白沉淀后，以流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液對奧沙西泮進行梯度洗脫，以電噴霧離子源正離子多反應監測模式進行質譜分析，并通過多個特征離子對和保留時間對唾液中奧沙西泮進行定性分析。用UPLC-MS/MS法檢測唾液中的奧沙西泮，該檢測方法提取回收率高，大于90%；基質效應低，唾液樣品無需加酶水解，樣品前處理簡便；檢測方法靈敏度高，檢出限低于0.1 ng·mL-1，準確度高。

表3 唾液樣品中奧沙西泮的檢測結果 ng·mL-1

5名志愿者65份唾液樣品中均檢出奧沙西泮成分，其中57份唾液樣品中奧沙西泮的含量高于定量限，8份僅能定性分析，研究表明：在人服用奧沙西泮12 h內，唾液中仍可檢出一定量的奧沙西泮，且含量相對穩定。因此，可以選取唾液樣品作為生物樣品中奧沙西泮的檢材，為體內濫用精神活性藥物檢測提供了一個有效的分析方法。

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