常見嗜尸性蠅類不同部位3種DNA提取方法比較

郭奕瓊，趙琳琳，姚澤偉，蔣 璇，張亞楠，翟仙敦

死亡時間(postmortem interval,PMI)，尤其是高度腐敗尸體的死亡時間推斷一直是現階段法醫偵破案件中的一大難題。嗜尸性蠅類在人死后很快即可到達尸體，并在其上產卵、孵化、成蛹、破殼發育到成蟲，并逐漸演替成為群落直至白骨化，根據嗜尸性蠅類的生長發育規律和群落演替規律可以為死亡時間推斷提供依據。因此，利用嗜尸性昆蟲進行PMI推斷是法醫學重要的研究方向之一[1-5]。傳統的嗜尸性蠅類形態學鑒定對鑒定人員經驗依賴性很高，隨著生物學技術的發展，蠅類分子鑒定顯示了無可比擬的優勢，其中DNA的提取是關鍵限速步驟[1]。本實驗通過對Chelex-100法、試劑盒法、酚—氯仿法3種方法的不同部位提取效果的比較，旨在尋找一種操作簡單、成本低、對蠅類完整形態破壞小、常規分子生物學實驗室即可完成，并且可以滿足實踐需要的嗜尸性蠅類DNA提取方法，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1嗜尸性蠅類樣本豬肝誘捕并采集河南科技大學食堂排污管下大頭金蠅，室溫晾干，并選取體積大小相似的樣本24只。每種方法隨機選取8只樣本，每個樣本分別提取頭、胸肌、足、翅4部分，足和翅選取單側同側組織，在去離子水中清洗后吸水紙吸干，置于離心管中，用眼科剪剪碎。

1.1.2主要試劑和儀器蛋白酶K、TaKaRa?Mini BEST提取試劑盒、擴增試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，Chelex-100(美國伯樂公司)，氯仿、異戊醇、無水乙醇、氯化鈉、乙二胺四乙酸二鈉(天津永大化學試劑有限公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS)，Tris-HCl(BIOSHARP公司)，Tris-平衡酚(北京索萊寶科技有限公司)，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，FLA6000型微量紫外分光光度計(杭州晶飛科技有限公司)，9700 PCR儀(美國ABI公司)，一體式核酸電泳儀(英國Cleaver公司)。

1.2方法

1.2.1酚—氯仿法參照文獻[1,6-10]的提取方法，部分步驟改動。將剪碎的組織置于1.5 mL離心管中，加入400 μL 1×TNE，1/10體積的10% SDS(約40 μL，終濃度為1%)、1/100體積(10 mg·mL-1)PK(約4 μL，終濃度為100 μg·mL-1)，混勻。56 ℃水浴2～3 h后加入12 μL PK，然后過夜水浴消化。加入等體積(約500 μL)酚/氯仿/異戊醇(V/V/V =25∶24∶1)，以上下顛倒離心管方式混勻液體5 min，至管內液體混合成乳狀液，5 000 r·min-1，離心5 min。吸取上層水溶液轉移至新管，重復上一步兩遍，直至水相和有機相之間看不到蛋白質為止(胸肌樣本重復3遍)。吸取上層水溶液轉移至新管，加入等體積(約420 μL)氯仿，倒轉混勻5 min，5 000 r·min-1，離心5 min。吸取上層水溶液轉移至新管，加入2倍體積(約900 μL)的預冷無水乙醇(-20 ℃)，輕柔顛倒混勻，沉淀出DNA，低溫離心4 ℃ 12 000 r·min-1，離心15 min，棄上清。加入70%預冷乙醇1.5 mL，混勻，低溫離心4 ℃ 12 000 r·min-1，離心5 min，棄上清。重復此步驟2～3次，室內自然晾干，加150 μL去離子水溶解DNA，4 ℃保存。

1.2.2Chelex-100法參照尹曉宏等[2]的提取方法，部分步驟改動。將剪碎的組織置于0.6 mL離心管中，加入5% Chelex-100 200 μL，PK(10 mg·mL-1)2 μL(終濃度100 μg·mL-1)56 ℃水浴2～3 h后，觀察上清液澄清透明度，再加入PK(10 mg·mL-1)8 μL，過夜消化。100 ℃水浴15 min，取出后高速渦輪振蕩5～10 s。低溫離心4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，4 ℃保存。

1.2.3試劑盒法將剪碎的組織置于1.5 mL離心管中，使用TaKaRa?Mini BEST試劑盒，參照說明書提取DNA。

1.3DNA質量濃度和純度檢測

1.3.1微量紫外分光光度計法使用微量紫外可見分光光度計測定DNA樣品的D260、D280，并計算D260/D280比值。

1.3.2凝膠電泳檢測0.8%瓊脂糖凝膠，溴化乙錠染色，DNA樣品5 μL混合1 μL上樣緩沖液，120 V電泳60 min，置于凝膠成像系統觀察并拍照。

1.3.3PCR擴增及電泳檢測參照文獻[11-14]改動部分步驟。擴增細胞核28S rRNA基因中長度約750 bp(F：5’-GACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3’；R：5’-GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAG-3’)?？偡磻w系10 μL，含2×TaKaRa?premix 5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2～0.4 μL，DNA模板0.2～1.2 μL，ddH2O補足體系。PCR擴增反應參數：94 ℃預變性1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃1 min 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共5次循環；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 1 min，共35次循環；72 ℃延伸8 min。擴增產物4 ℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，35 min)，溴化乙錠染色，電泳后置于凝膠成像系統拍照分析。

2 結果

2.1DNA濃度和純度檢測結果酚—氯仿法頭和胸肌D260/D280值位于1.87～2.08之間，足和翅分別位于1.24～1.84和1.09～1.70之間，其中足有兩個樣本值是2.15、2.47；Chelex-100法D260/D280值多小于1.62；試劑盒法D260/D280值頭位于1.52～1.81之間，胸肌、足、翅分別位于2.98～7.63、2.86～5.84和4.08～6.60之間，其中足有1個樣本值是1.41，見表1。經統計學方法檢驗發現，D260/D280比值3種方法存在差異(P=0.000)，說明3種不同的方法提取的DNA純度存在差異；不同部位之間存在差異(P=0.001)，說明不同部位提取的DNA純度存在差異；方法和部位之間存在交互作用(P=0.000)，說明不同的方法對應不同的提取部位會有不同的DNA純度。DNA濃度3種方法之間存在差異(P=0.000)，說明3種不同的方法提取的DNA濃度存在差異；不同部位之間存在差異(P=0.000)，說明不同部位提取的DNA濃度存在差異；方法和部位之間存在交互作用(P=0.000)，說明不同的方法對應不同的提取部位會有不同的DNA濃度。

表1 3種方法提取大頭金蠅不同部位DNA純度和濃度值

注：不同方法、不同部位提取的DNA純度和濃度差異均有統計學意義。(P<0.05)。

2.2電泳檢測結果酚—氯仿法和試劑盒法頭和胸肌均有明顯條帶，足條帶相對較弱，片段長度>10 kb，但酚—氯仿法有拖尾現象。翅幾乎看不到條帶。Chelex-100法4個部位均未看到明顯條帶，見圖1。

泳道1：1 kb DNA ladder；2：100 bp DNA ladder；3～10：酚—氯仿法；11～18：Chelex-100法；19～26：試劑盒法。圖1 大頭金蠅不同部位3種方法提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3PCR產物電泳檢測結果3種方法4個部位提取的DNA均成功擴增出約750 bp的目的產物(圖2)，包括圖1中不能看到條帶的樣本。試劑盒法的頭，胸肌，足3個部位，酚—氯仿法和Chelex-100法的足擴增效果均很好，酚—氯仿法和Chelex-100法頭和胸肌的模板DNA均經過不同程度的稀釋，并調整引物濃度后成功擴增。3種方法提取的翅DNA增加模板量后擴增效果明顯變好(圖2中未列出)。

泳道1：100 bp DNA ladder；2～9：酚—氯仿法；10～17：Chelex-100法；18～25：試劑盒法。圖2 大頭金蠅不同部位3種方法提取DNA的擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

DNA提取是嗜尸性蠅類分子鑒定中最關鍵的環節，其提取方法和提取后的DNA質量直接影響后續的檢測。本實驗3種方法均能提取并擴增成功，其中酚—氯仿法操作步驟多、過程繁瑣，并且經過多次轉移后DNA損耗相對較大，但是提取的DNA樣品純度最高，濃度也較高，因此雖然酚—氯仿法操作繁瑣，但依舊是研究人員最常采用的常規方法；Chelex-100法操作簡便，試劑安全無毒，單管操作DNA損失小，其提取的DNA樣品濃度最高，例如尹曉宏等[2]通過對比并改良了Chelex-100法后得出其優點，但蛋白質污染嚴重，樣品純度不高，并且Chelex-100法在提取過程中使雙鏈DNA變性成單鏈，因此Chelex-100法提取的DNA只適用于進行基于PCR的分析；試劑盒法成本相對較高，提取的DNA濃度較低，但是其PCR擴增效果最佳。對大頭金蠅軀體4部分DNA提取分析發現，頭和胸肌提取的DNA濃度最高，這也在其他文獻中得到證明[1]，但是采用這兩個部位對蠅類形態完整性破壞太大，并且胸肌腐敗時檢材很難提取。足和翅分別對稱分布，雙側均有，提取一側組織后仍可保留較完整的形態特征，但翅檢材量較少且易丟失，提取的DNA濃度較低，對后續研究來說存在較大風險，因此作者認為蠅類的足是提取DNA的最佳檢材。

在DNA質量檢測方面(表1)，利用微量紫外分光光度計對其進行檢測，通過計算D260/D280的比值判斷DNA純度。一般認為D260/D280在1.8～1.9時純度較高，>1.9時有RNA污染，<1.6時有蛋白質或酚污染。但在實際操作中，并不能只根據這些數據判斷是否提取成功，而應該同時結合電泳和擴增結果。比如，此次實驗中，試劑盒法所提取的DNA樣品在紫外分光光度計定量測量時，其數據并不理想，整體數值大部分偏高，可能是由于提取的樣本中RNA 含量過高所導致的，但是在電泳和擴增結果中，試劑盒法的結果較為理想(圖1-2)，提取產物和擴增產物電泳時均出現明亮清晰的條帶。在實驗中，作者還嘗試Chelex-100法提取DNA時加入DTT(二硫蘇糖醇)改良實驗效果[15-16]，分別選用同一樣本的對側足和翅在消化時加入DTT與未加DTT的樣品進行對比，結果表明加入DTT對Chelex-100法所提取的DNA濃度有所提高，這可能與足和翅的組織成分有關，但是這需要更多的理論支持和實驗驗證。

總體來說，通過本次研究發現，3種提取方法各具優勢，針對不同的實驗需求，應采用不同的DNA提取方法。制備高純度低成本DNA推薦使用酚—氯仿法，提取高濃度樣品推薦使用Chelex-100法，若要得到最佳的擴增效果推薦使用試劑盒法。鑒于法醫昆蟲DNA的研究一般都是基于PCR的分析，作者建議采用Chelex-100法提取單側足部DNA。

參考文獻：

[1] 郭亞東,蔡繼峰,蘇日娜,等.常見嗜尸性甲蟲及蠅類蟲體不同部位mtDNA的提取效果[J].法醫學雜志,2010,26(5):336-339.

[2] 尹曉宏,王江峰.一種嗜尸性蠅類干樣本DNA提取方法的改良[J].中國法醫學雜志,2010,25(4):272-273.

[3] Harvey ML,Gaudieri S,Villet MH,et al.A global study of forensically significant calliphorids: implications for identification[J].Forensic Sci Int,2008,177(1):66-76.

[4]Wells JD,Stevens JR. Application of DNA-based methods in forensic entomology[J].Annu Rev Entomol,2008,53:103-120.

[5]Harvey ML,Dadour IR,Gaudieri S.Mitochondrial DNA cytochrome oxidase I gene:potential for distinction between immature stages of some forensically important fly species (Diptera) in western Australia[J].Forensic Sci Int,2003,131(2/3):134-139.

[6] 印紅,劉曉麗,王彥芳,等.一種改進的昆蟲基因組DNA的提取方法[J].河北大學學報(自然科學版),2002,22(1):80-82.

[7] 葛振萍,張春田,智妍,等.一種有效的寄蠅基因組DNA的提取方法[J].醫學動物防制,2007,23(3):165-166.

[8] 陳瑤清,郭亞東,李茂枝,等.常見嗜尸性昆蟲mtDNA提取方法的比較[J].法醫學雜志,2011,27(4):265-270.

[9] 游源淺,陳艷,易建平,等.松突圓蚧基因組DNA提取方法的比較[J].華東昆蟲學報,2007,16(1):26-29.

[10]楊子祥,馮穎,陳曉鳴.一種有效的蚜蟲基因組DNA提取方法[J].林業科學研究,2005,18(5):641-643.

[11]趙琳琳,翟仙敦,張振,等.洛陽地區常見嗜尸性麗蠅的COI序列分析[J].河南科技大學學報(醫學版),2016,34(4):286-288.

[12]He L,Wang S,Miao X,et al.Identification of necrophagous fly species using ISSR and SCAR markers[J].Forensic Sci Int,2007,168(2/3):148-153.

[13]蔡繼峰,劉敏,應斌武,等.mtDNA中COⅠ分子標記在常見食尸性蠅類鑒定中的應用[J].昆蟲學報,2005,48(3):380-385.

[14]Machida RJ,Miya MU,Nishida M,et al.Large-scale gene rearrangements in the mitochondrial genomes of two calanoid copepods Eucalanus bungii and Neocalanus cristatus (Crustacea),with notes on new versatile primers for the srRNA and COI genes[J].Gene,2004,332:71-78.

[15]胡利平,聶勝潔,杜雷,等.3種提取高度腐敗檢材DNA的方法比較[J].中國法醫學雜志,2006,21(5):299-299.

[16]聶勝潔,楊彥梅,唐文如,等.指甲游離緣的核DNA分型研究[J].遺傳,2007,29(11):1373-1377.