NADPH-d在大鼠三叉神經節的表達

劉永亮，丁桂聰

深圳市兒童醫院口腔科，廣東深圳 518000

三叉神經節（trigeminal ganglion,TG)是三叉神經傳導通路的主要初級傳入神經元，主要負責頜面部的機械感覺、溫度感覺與痛覺傳導，在頜面部感覺調控發揮重要作用[1-2]。

一氧化氮（nitric oxide,NO)雖是短半衰期的自由基分子，但在疼痛傳導調控中發揮著重要作用，受到廣泛關注[3-4]。NO是以左旋精氨酸（L-Arginine）為底物，由一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase,NOS）合成。而NOS有3種亞型，包括神經元型NOS（constitutive neuronal NOS,nNOS）， 誘導型 NOS（inducible NOS,iNOS）與內皮型 NOS（endothelial NOS,eNOS）。nNOS與eNOS又稱為固有型NOS，屬于鈣依賴型，主要存在于中樞神經系統。iNOS主要存在于巨噬細胞和白細胞，其功能不受胞內Ca2+調節，由細胞因子和內毒素調節[5]。NOS的激活依賴還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phos phate,NADPH），文獻報道NADPH-d與nNOS在相同的細胞群中表達，并且兩者的活性與NO的產生量呈平行關系。因此，NADPH-d組織化學染色可作為NOS以及NO生成量的非直接指示因素[6-7]。大量研究認為NO參與頜面部疼痛信號的調控[8-9]。探究NADPH-d在TG的分布情況對研究NO/NOS系統在頜面部疼痛傳導通路中的作用十分必要。

因此該研究選擇健康雌性大鼠，190～220 g，2015年5月，經心灌注固定取雙側三叉神經節，25 μm冰凍切片，采用組織化學染色方法研究NADPH-d在TG的表達情況。

1 材料與方法

主要實驗試劑：NADPH-d（美國Sigma公司）硝基四唑氮藍（美國Sigma公司）；實驗動物選用健康成年雌性Sprague-Dewley大鼠6只，體重190～220 g，由廣東省實驗動物中心提供；4%多聚甲醛經心灌注固定，取 TG 梯度脫水，冰凍切片（25 μm）；NADPH-d組織化學染色；圖像分析。

2 結果

NADPH-d在三叉神經節廣泛表達，呈簇狀緊密排列，以中小細胞為主。染色密度與細胞體積相關，即大體積細胞多數染色較淡或為陰性，邊界不清晰。而大多中小體積細胞染色較深，見圖1、表1。

圖1 NADPH-d在三叉神經節（TG）神經元內的表達

圖A,B：NADPH-d組織化學染色，圖C,D：NADPH-d組織化學染色灰度照片。黑色/紅色/藍色箭頭代表深染小細胞、中等大小細胞、淺染大細胞。比例尺：100 μm(C),50 μm(D)

表1 NADPH-d陽性細胞體積比例

3 討論

結果表明NADPH-d在TG廣泛分布，并且中小細胞染色較深，表現更高的NADPH-d活性，而大細胞染色較淺甚至表現為陰性，與Stoyanova等[6]與Fan等[10]在大鼠的檢測結果及Kolesar[11]等在兔的檢測結果類似。該次的結果還補充了中小細胞是主要的NADPH-d陽性細胞，占73.2%。中小體積TG細胞被認為是主要處理傷害性信息的細胞[10]，無論NADPH-d染色深度或數量占比，中小體積細胞均比大體積細胞突出，這為NONO/NOS系統參與頜面部疼痛調控提供了形態學支持。

除了類似的大鼠生理性形態研究外，也有一些檢測NO/NOS在病理狀態下的表達情況，主要集中在三叉神經系統初級與二級神經元，即三叉神經節、三叉神經中腦核與三叉神經脊束核。有研究[7]報道了一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）在 TG、三叉神經脊束核尾核及中腦導水管、丘腦等與疼痛相關核團均有表達，認為NO/NOS系統是偏頭痛的發病機制之一。Liu等[12]報道了大鼠慢性牙髓炎模型中，NOS陽性神經元在TG的表達最早在第3天開始增加，第28天達到峰值。Sugiyama等[13]報道大鼠下牙槽神經橫斷可引起機械異常痛覺，并且NO代謝物及NOS陽性細胞在TG表達增加。在TG局部使用NOS選擇性抑制劑可以消除異常痛覺而NOS底物可誘發異常痛覺。Huang F等[14]報道了在炎性痛的早期TG中、小神經元NADPH-d活性增強。這些證據表明NO/NOS系統參與頜面部疼痛調控。

然而，需要指出的是盡管以上研究傾向于NO在頜面部疼痛調控中發揮致痛作用，較早研究報道在糖尿病誘發神經痛的大鼠中，脊髓背根神經節的NADPH-d陽性細胞與nNOS表達明顯減少，而且胰島素治療可以逆轉這一效應，這提示NO可能起抑痛作用[15]。Hashemi M等[16]在嗎啡鎮痛的大鼠福爾馬林測試中觀察到NO存在鎮痛/抑痛的復雜作用。研究認為這可能與NO的濃度相關；不同的傷害形式、持續時間和強度等激活不同的傳入神經對于nNOS的表達起關鍵性作用，也可能影響NO的疼痛調控作用[17-18]。

綜上所述，NO/NOS系統在頜面部疼痛中調控中發揮重要作用，但當前結果遠遠不足以闡明其具體機制。至今，NADPH-d陽性細胞在三叉神經通路的整體表達尚未明確，尤其是丘腦腹后內側核與大腦皮層等，值得進一步研究；與一些信號因子如降鈣素基因相關肽（calcitonin-gene-related peptide，CGRP）的關系也有待深入研究。

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