東北油豆角枯萎病病原菌的分離、純化與鑒定

王 杰，周 萌，杜偉玲

（哈爾濱市農業科學院生物中心，黑龍江 哈爾濱 150029）

油豆角是我國東北地區（黑龍江、吉林為主）特有的一種優質食莢菜豆品種，含有較高的蛋白質（干質量的20%以上），含有人體必須的18種氨基酸、豐富的膳食纖維、多種維生素和礦物質。

油豆角枯萎病俗稱萎蔫病、死秧。一般發病率在30%～50%，個別重病田病株率高達90%以上。病原菌通過根部傷口或根毛頂端細胞侵入，進入寄主導管內發育，隨水分的運輸迅速擴展到植株頂端，堵塞導管，而使病株萎蔫。初花期開始發病，結莢盛期植株大量枯死，嚴重阻礙油豆角生產。

為了控制枯萎病的危害，首先要研究其發病的原因。試驗對引起發病的病原菌進行分離和鑒定，以期為有針對性地防治該病害奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

PSA培養基：去皮馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉15 g，加水至1 000 mL，pH值5.0～6.0；致病性鑒定所使用的油豆角品種：將軍一點紅（當地主栽品種）。試劑盒：Ezup 柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離

采用組織分離法：將剪取的油豆角莖基部病組織樣品經2.0%（V/V）NaClO表面滅菌0.5～1.0 min，再用滅菌蒸餾水沖洗。用滅菌濾紙將樣品擦干，后用解剖刀將其切成小薄片，置于含有PSA 培養基的培養皿中，28±2 ℃的培養室中培養5～7 d，將從樣本中得到的分離物進行單孢分離（稀釋分離法），將單孢分離物轉接于新的含有PSA培養基的培養皿中，28±2 ℃條件下培養7 d備用。

1.2.2 病原菌的鑒定

形態學觀察：培養7～10 d后觀察菌絲體形態，采用數碼倒置顯微鏡EVOS觀察其分生孢子的形態。

致病性測定：病原菌的接種方法參考Haware和Nene[1]的方法。將玉米粉與蛭石按1∶2（V/V）的比例制成混合物，在1 000 mL規格的三角瓶中裝入400 mL混合物，121 ℃、0.2 MPa條件下滅菌30 min，滅菌2次。向玉米粉混合物中加入50 mL滅菌蒸餾水，混合均勻后接入病原菌（培養皿直徑為90 mm，且長滿病原菌菌絲），25～28 ℃條件下培養7～10 d，每天搖晃三角瓶使病原菌均勻生長。將接種體與滅菌的營養土按照1∶10（V/V）的比例混合，取0.01 g接種混合土懸浮于1 mL滅菌水中，用血球計數板計算接種混合土中病原菌的含量，使接種終濃度達到5.0×106cfu/g。將用0.5%NaClO溶液表面滅菌的油豆角種子播種于裝有上述接種混合土的營養缽中，致病性測定在人工氣候箱中進行，30±2 ℃條件下，每日光照12 h，適時澆水。以未接種病菌的滅菌營養土作為對照，定期觀察植株生長情況。根據柯赫氏法則，從發病的植株上再次分離病原菌進行純培養，并觀察其特征。

分子生物學鑒定：應用Ezup柱式真菌基因組 DNA 抽提試劑盒進行病原菌基因組DNA提取。PCR擴增采用真菌鑒定通用引物ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC；PCR 反應體系：Template（基因組 DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL、10×Buffer（加Mg2+）2.5 μL、dNTP（各2.5 mM）1 μL、Taq酶0.2 μL、ITS1（10 μM）0.5 μL、ITS4（10 μM）0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR循環條件：預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共計30個循環，然后72 ℃延伸修復10 min，4 ℃終止反應；用1%瓊脂糖凝膠電泳，150 V、100 mA電泳20 min；用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收目標條帶，PCR產物交由上海生工生物工程有限公司直接測序。將測得的rDNA-ITS序列放到NCBI基因序列數據庫中，并利用BLAST技術進行分析。

專化型鑒定：方法同上述致病性鑒定方法，只是把接種對象擴大到豇豆、扁豆、豌豆、菜用大豆和蠶豆，其中包括油豆角，每處理接30株苗，以清水處理作為對照。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態

在固體馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養基上，菌落呈淡紫色；大型分生孢子鐮刀形，有3～5個隔；小型分生孢子橢圓形，有0～1個隔（圖1）。

2.2 病原菌的致病性鑒定

未接種病原菌的植株正常生長（圖2-A左）；接種病原菌的植株出現的白化現象后萎蔫（圖2-A右），其莖的維管束變褐色（圖2-B）。試驗共分離到鐮刀菌菌株6株，其中對油豆角（將軍一點紅）有致病性的1株。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

病原菌的rDNA-ITS序列測定結果如下：

將DNA序列放到NCBI核酸數據庫中通過BLAST比對，結果顯示此序列與近100個尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）分離物或專化型同源性達100%，由此可以推斷，病原菌應該屬于尖孢鐮刀菌種。

2.4 專化型鑒定

以清水為對照，寄主為油豆角，其發病率為0.00%。另外，從表1可以看出：病原菌強侵染油豆角，弱侵染豇豆，不侵染扁豆、豌豆、菜用大豆和蠶豆。

3 結論與討論

鐮刀菌的鑒定是一項非常復雜的工作，傳統方法主要采用形態特征和生理生化指標作為判斷依據，方法容易受多種外界因素的影響而產生很大的不確定性。自從發現真菌rDNA-ITS區具有豐富變異的特點，常常將這一可變區作為真菌菌種和分離物鑒定的可靠依據之一[2]。劉波等[3]對引起瓜類枯萎病的尖孢鐮刀菌多個菌株的rDNA-ITS區序列及串珠鐮孢菌多個菌株的rDNA-ITS區序列進行多重比較，結果發現：來自不同專化型的菌株rDNA-ITS區序列可能完全相同，而同一專化型的菌株rDNA-ITS區序列也有可能存在一定的差異，說明ITS區序列無法用于區分菌株的專化型。另外，余仲東等[4]也認為ITS區序列不適于種下階元劃分。研究中，2株病原菌rDNA-ITS區序列與近100個尖孢鐮刀菌分離物或專化型的同源性達100%，再次驗證了通過rDNA-ITS區序列只能鑒定到種而無法鑒定到種以下分類單元（比如專化型）這一事實。

表1 尖孢鐮刀菌專化型鑒定結果

圖1 病原菌形態及分生孢子

圖2 油豆角病原菌的致病性鑒定情況

張吉祥等[5]歸納總結了DNA分子標記（包括RFLP、RAPD、AFLP、ISSR和SCAR等）、毒性基因和轉座子等技術在尖孢鐮刀菌專化型及其生理小種鑒別方面的應用，指出分子方法盡管具有快速、靈敏、特異性高等諸多優點，但也都有各自的局限性，限制了其廣泛應用。在生產上，尖孢鐮刀菌專化型鑒定大部分還是利用傳統的鑒定方法，主要通過菌株在不同作物上的致病性測定。

結合形態學、分子生物學和專化型的鑒定結果，可初步把病原菌鑒定為尖孢鐮刀菌菜豆專化型。

[1]HAWARE M P, NENE Y L. Races ofFusarium oxysporum[J]. Plant Disease,1982,66(9):809-810.

[2]SCHMIDT O, MORETH U. Data band of rDNA-ITS sequences from building-rot fungi for their identification[J]. Wood Science and Technology,2002,36(5):429-433.

[3]劉波,黃俊生,肖榮鳳.尖孢鐮刀菌生物學及其生物防治[M].北京:科學出版社,2013.

[4]余仲東,劉小勇,曹支敏.松楊柵銹菌的ITS序列和微衛星分析[J].中國農業科學,2006,39(6):31-34.

[5]張吉祥,凌鍵,謝丙炎.尖孢鐮刀菌專化型及生理小種分子檢測研究進展[J].中國農學通報,2013,29(36):338-342.蔬