一株結晶紫脫色菌的分離鑒定及脫色性能初步研究

楊云朧　牛秋紅

摘 要：目的：分離和鑒定結晶紫脫色菌。方法：從采集水樣中分離篩選到一株三苯甲烷類染料結晶紫降解菌WL7，通過培養、形態、生理生化及16S rDNA序列同源性比較進行鑒定，研究在不同接種量、培養溫度、初始pH和培養時間下菌株WL7對結晶紫的脫色性能。結果：菌株WL7被鑒定為一株節桿菌（Arthrobacter rhombi WL7），對結晶紫具有較高的脫色能力，結晶紫含量為20 mg/L時，最高脫色率可達88.9%。結論：在結晶紫廢水的處理領域WL7具有潛在的應用前景。

關鍵詞：結晶紫；脫色；分離；16S rDNA序列

中圖分類號 X703 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）02-0028-04

Abstract：Objective：To isolate and identify crystal violet decoloring bacteria.Method：Cultural，morphological，physiological and biochemical and 16S rDNA sequence characteristics were applied to confirm the classification of isolation strains.Preliminary study on different inoculation size，culture temperature，initial pH and culture time of strain WL7 on crystal violet decolorization performance were performed.Result：A bacterial strain WL7 capable of decolorizing triphenylmethane dyes crystal violet was isolated from the collected water samples.WL7 was identified as Arthrobacter rhombi.WL7 have high decolorization ability on crystal violet of 20 mg/L，the highest decolorization rate is 88.9%.Conclusion：WL7 has potential application prospect in the treatment of crystal violet wastewater.

Key words：Crystal violet；Decolorization；Isolation；16S rDNA sequence

結晶紫是一類難以降解且對許多生物都具有致癌、致畸性的三苯甲烷類染料[1-2]，廣泛應用于油墨、紙張、印染、制革和紡織等行業[3]，產生了大量高色度的染料廢水，引起嚴重的水體和土壤污染[4]。目前水體中染料去除的主要方法有物理脫色法、化學脫色法[5，6]和生物脫色法[7-11]。物理和化學法見效快，成本高，易引起二次污染，其使用一直受到制約[12]。生物脫色法被視為一種環境友好型的方法[12-13]，主要包括吸附和降解脫色2種類型[10]，具有成本低、效率高等特點，越來越受到科研人員的青睞。理化方法處理三苯甲烷染料廢水效果不理想，高濃度的三苯甲烷染料也抵抗微生物的礦化，因此尋找高效的三苯甲烷染料脫色菌已成為研究焦點，并對脫色方式及機理進行了大量研究[14-17]。本文以結晶紫為目標染料，分離并鑒定了一株結晶紫脫色菌WL7，并對其脫色機理和脫色性能進行了初步研究，旨在為三苯甲烷類染料染料的生物脫色方法及其在生產實際中的潛在應用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 樣品采集自南陽市臥龍區某印染廠廢水池上層水樣。結晶購于紫天津市科密歐化學試劑開發中心；蛋白胨和牛肉膏購于北京奧博星生物技術有限責任公司；瓊脂購于美國Sanland公司；無水乙醇（分析純）購于萊陽市雙雙化工有限公司。

1.2 儀器及設備 精密電子天平（JJ300型，常熟雙杰儀器廠）；恒溫培養箱（GHP-9160型，上海一恒科技公司）；Nikon E-600微分干涉顯微鏡；離心機（DSX-280B型，上海申安醫療器械廠）；恒溫振蕩器（THZ-928型，上海躍進醫療器械廠）；高壓滅菌鍋（上海申安醫療器械廠）；超凈工作臺（SW-CJ-1F型，蘇州凈化設備有限公司）；紫外及可見分光光度計（Evolution 600 BB型，英國熱電公司）。

1.3 方法

1.3.1 培養基的配制 牛肉膏蛋白胨培養基，其具體配方及配制方法見參考文獻[18]，其中固體培養基瓊脂含量為1.5%，富集和篩選培養基中結晶紫濃度均為20mg/L。

1.3.2 菌株富集和篩選 將從印染廠采集的染料廢水取5mL接種于45mL富集培養液中在35℃、150r條件下進行培養，定期觀察，取5mL脫色的富集培養物繼續接種到45mL富集培養液中同條件下繼續培養至脫色，挑取脫色液劃線到含結晶紫的固體培養基上，于恒溫箱內35℃培養至菌落產生，挑選菌落周圍出現顯著脫色區的菌落繼續劃線純化獲取單菌落，并對其進行單染色，用Nikon E-600微分干涉顯微鏡進行鏡檢。

1.3.3 分離菌株的鑒定 參照《常見細菌系統鑒定手冊》的操作方法，對分離菌株的培養、形態及生理生化特征進行檢測[19]；16S rDNA序列測定的測定委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行。將獲得的16S rDNA序列在GenBank中進行同源性比較，選取同源性較高的16S rDNA序列，采用軟件Clustalw2.0.10進行多序列匹配排列后MEGA6.05軟件鄰接法構建系統發育樹。

1.3.4 分離菌株脫色性能的研究 菌株WL7接種于含50mL牛肉高蛋白胨液體培養基的250mL的三角瓶中，于35℃，150r培養24h制備種子液。以5%的接種量、轉速150r、35℃、初始pH7和培養時間24h為基礎條件，分別研究菌株WL7在不同接種量、培養溫度、初始pH和培養時間對結晶紫的脫色效率，設置3個平行，定時取樣，測吸光值。

1.3.5 脫色率檢測 取培養液以8000r離心5min，在結晶紫最大吸收波長589nm處測量上清液的吸光值，以不接菌染料溶液為對照，結果取3個平行平均值計算脫色率[20]。以脫色率來表示菌株WL7對結晶紫的脫色能力：

脫色率（%）=（A0-At）/A0×100

式中：A0表示不接菌溶液的吸光值，At表示接菌t時間時溶液的吸光值。

2 結果與分析

2.1 染料脫色菌的分離 對采集的染料廢水進行富集培養，選擇脫色程度大及脫色時間短的培養物繼續進行富集培養，脫色培養物劃線含結晶紫的牛肉膏蛋白胨平板35℃培養，24h時選擇周圍形成明顯的脫色圈的菌落繼續劃線分離純化，獲得一株染料脫色菌WL7。在牛肉膏蛋白胨平板上WL7菌落圓形隆起，呈乳白色，不透明，邊緣整齊，菌體呈桿狀，兩端鈍圓，無芽胞。

2.2 菌株WL7的生理生化特征 菌株WL7的生理生化特征見表1。從表1可以看出，菌株WL7接觸酶陽性，氧化酶陰性，氧化葡萄糖不產酸不產氣；硝酸鹽還原、V.P.試驗、甲基紅試驗、吲哚試驗及硫化氫試驗均為陰性。可以利用果糖、蔗糖、阿拉伯糖等多數碳源，不能利用棉籽糖和山梨醇。參照《常見細菌系統鑒定手冊》，菌株WL7的生理生化特征與節桿菌屬細菌高度相似[19]。

2.3 菌株WL7的分子鑒定 菌株WL7的16S rDNA的測序結果為1410個核甘酸，行BLAST比對，選取同源性較高的12株菌的16S rDNA序列匹配排列后構建系統進化樹（圖1），從圖1可以看出，菌株WL7與節桿菌屬的多株細菌同源性較高，與節桿菌（Arthrobacter rhombi）處于同一分支，因此結合生理生化特征初步把菌株WL7鑒定為一株節桿菌（Arthrobacter rhombi WL7）。株WL7與節桿菌屬的多株細菌同源性較高，與節桿菌（Arthrobacter rhombi）處于同一分支，因此結合生理生化特征初步把菌株WL7鑒定為一株節桿菌（Arthrobacter rhombi WL7）。

2.4 菌株WL7的脫色性能

2.4.1 培養時間對脫色效果的影響 培養時間對脫色效果的影響見圖2。由圖2可知，接種量為5%，培養條件為35℃、150r、初始pH7時，24h的脫色率為81.3%；36h的脫色率即可達到85.6%，其后脫色率緩慢增加，72h的脫色率即可達到88.9%。培養至24h期間脫色率呈指數增長，其后脫色率相對穩定，無顯著的提高，因此下述實驗均考察24h的脫色率來比較菌株WL7的脫色性能。

2.4.2 接種量對降解效果的影響 從圖3可以看出，培養24h接種量對脫色效果影響較大，接種量也大，培養時間內的脫色率越高。當接種量為1%～5%時，脫色率升高較快，當接種量高于7%后，脫色率均在87.3%以上，接種量對脫色率的影響趨于變小。接種量與脫色率呈正相關表明在培養24h內，接種量越大，菌體生長越迅速，延滯期越短，脫色效果越明顯。

2.4.3 溫度對降解效果的影響 考察了15～50℃范圍內溫度對脫色效率的影響，從圖4可以看出，溫度對脫色率的影響較大。溫度為30℃時，24h的脫色率最高，可達到84.5%。15～30℃范圍內，脫色率逐步提高，30～40℃范圍內，脫色率逐步降低，45℃和50℃脫色率急劇降低，這可能是由于高溫過高對菌株WL7生長有抑制作用，導致生物量過，也可能溫度過高影響降解結晶紫的酶的活性，因而影響脫色效果。溫度為20℃時，24h的脫色率仍可達到70%以上，表明菌株WL7對自然水體中結晶紫的去除有較大的潛在應用前景。

2.4.4 初始pH對脫色效果的影響 初始pH對脫色效果的影響如圖5。由圖5可知，初始pH對脫色效果影響也較大。初始pH為5和9時脫色率相對較低，pH為5時，脫色率脫色率僅為63.2%，初始pH在中性范圍附近，24h的脫色率相對較高，pH為7時，脫色率脫色率達到最高，為81.7%。

3 討論

從采集水樣中分離得到一株三苯甲烷類染料結晶紫降解菌WL7，初步鑒定為一株節桿菌（Arthrobacter rhombi）。在不同接種量、培養溫度、初始pH和培養時間下菌株WL7對結晶紫表現不同的脫色性能。菌株WL7在較高的溫度和初始pH范圍均有顯著的脫色作用，當結結晶紫含量為20mg/L時，最高脫色率可達88.9%，因此在結晶紫工業廢水的處理過程中具有潛在的應用前景，菌株WL7的脫色機理及脫色最佳工藝參數尚需進一步研究。

參考文獻

[1]都林娜，葉曙光，李剛，等.結晶紫高效脫色菌株的篩選、鑒定與脫色特性[J].江蘇農業科學，2015，43（9）：378-381.

[2]任隨周，郭俊，王亞麗，等.細菌脫色酶TpmD對三苯基甲烷類染料脫色的酶學特性研究[J].微生物學報，2006，46（3）：385-389.

[3]譙建軍，田萍，姚秉華，等.染料結晶紫降解菌分離及其特性研究[J].環境工程學報，2006，7（2）：62-65.

[4]李琛琛，凌琪，王莉，等.Sphingomonas sp.SJ-1對染料結晶紫的降解脫色特性[J].安全與環境學報，2014，14（6）：165-168.

[5]劉兵，汪家權，張發宇，等.光催化氧化與內電解法降解有機染料廢水的研究[J].安徽農業科學，2009，（22）：10653-10655.

[6]Faiza Rehman，Sayed Murtaza，Javed Ali Khan，et al.Removal of crystal violet dye from aqueous solution by gamma irradiation[J].Journal of the Chilean Chemical Society，2017，62：3359-3364.

[7]江瑩，桂震，齊杭杭，等.一株腐敗希瓦氏菌的篩選鑒定及其染料脫色研究[J].安徽農業科學，2015（23）：224-228.

[8]李凡姝，劉海洋，范麗莉，等.菌株Bacillus sp.CLb芽孢漆酶對染料、模擬染料廢水脫色的研究[J].安徽農業科學，2014（15）：4569-4572.

[9]尹立偉，楊春成，池玉杰.猴頭菌CB1染料脫色及其相關木質素降解酶的研究[J].安徽農業科學，2015（09）：250-253，256.

[10]董振，劉亮，郝艷，等.偶氮染料廢水處理技術的研究進展[J].水處理技術，2017（4）：6-10.

[11]Daniela Chmelová，Miroslav Ondrejovi c.Purification and characterization of extracellular laccase produced by Ceriporiopsis subvermispora and decolorization of triphenylmethane dyes[J].Journal of Basic Microbiology，2016，56（11）：1173-1182.

[12]張曉華，趙保衛，任學昌，等.一種三苯甲烷類染料脫色菌液的制備及其脫色性能[J].中國給水排水，2016（9）：98-102.

[13]王天廣.活性紅KE-3B的厭氧脫色研究[D].鄭州：河南大學，2012.

[14]譙建軍.三苯甲烷類染料廢水微生物降解研究[D].西安：西安理工大學，2005.

[15]Jingfei Luan，Yue Shen.Biodegradation of crystal violet with glyoxal oxidase as biocatalyst and further degradation of crystal violet with polythiophene-Gd2FeSbO7 as photocatalyst[J].Journal of Biotechnology，2016，231：S108.

[16]張曉昱，顏克亮，王宏勛.稻草稈粉基質中白腐菌對三苯甲烷類染料的降解特性[J].應用與環境生物學報，2006，12（2）：255-258.

[17]司靜，崔寶凱，戴玉成.東方栓孔菌在染料脫色中的應用及其脫色條件的優化[J].基因組學與應用生物學，2011，30（3）：364-371.

[18]沈萍.微生物學實驗[M].北京：高等教育出版社，2007.

[19]蔡妙英，東秀珠.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

[20]胡起靖，林玉滿，甘莉，等.一株嗜麥芽寡養單胞菌對結晶紫的脫色條件研究[J].福建師大學報（自然科學版），2008，24（2）：75-79.

（責編：張宏民）