桉樹葉片蛋白質(zhì)和硝態(tài)氮的動態(tài)觀察

朱宇林 周興文 卓艷霞 蘇建睦 譚萍

摘 要 研究桉樹葉片貯藏蛋白質(zhì)和硝態(tài)氮的動態(tài)變化規(guī)律，為提高桉樹氮素利用效率及實現(xiàn)人工林的可持續(xù)發(fā)展提供科學依據(jù)。采用考馬斯亮藍法和水楊酸法測定了桉樹葉片的蛋白質(zhì)含量和硝態(tài)氮含量，并探討葉片中硝態(tài)氮和蛋白質(zhì)之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：（1）桉樹葉片總蛋白質(zhì)含量隨季節(jié)發(fā)生規(guī)律性的變化，早春生長時期葉片蛋白質(zhì)含量急劇下降，至3月份下降到最低，之后在1.728～2.242 μg/mg FW呈波浪式變化；（2）桉樹葉片硝態(tài)氮含量也具有季節(jié)性的變化規(guī)律，冬季和春季時期硝態(tài)氮含量下降，從4月份開始上升，至6月份后又開始下降，秋季時期上升，總體上呈一個“W”字型的變化趨勢；（3）桉樹葉片硝態(tài)氮和蛋白態(tài)氮代謝的相關(guān)性并不顯著。綜合分析得出，桉樹的葉片中總蛋白質(zhì)含量的動態(tài)變化與樹木營養(yǎng)生長的變化規(guī)律相一致，可作為桉樹合理施肥的一個重要參考指標。桉樹春季生長所需的氮化物可能來自冬季休眠期積累的貯藏蛋白質(zhì)和葉片中的硝態(tài)氮。

關(guān)鍵詞 桉樹 ；貯藏蛋白質(zhì) ；硝態(tài)氮 ；氮代謝

中圖分類號 S792.39 ；Q949.762.2 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.019

Abstract The dynamic changes of the storage proteins and nitrate nitrogen of Eucalyptus leaves were observed to provide reference for improved uptake of nitrogen by Eucalyptus and sustainable development of Eucalyptus plantations. The protein content and nitrate nitrogen content in the leaves of Eucalyptus were determined according to the Lowry-Folin method and salicylic acid method， and the relationship between the leaf nitrate nitrogen and the leaf protein content were analyzed. The results showed that the total protein content of Eucalyptus leaves changed regularly with the seasons， declining sharply at the growth stage in early spring， down to the lowest in March， and changing between 1.728 and 2.242 μg/mg FW in a wave way. The nitrate content of Eucalyptus leaves also showed a regular change with the seasons， declining in winter and spring， up in April， down after June， up in autumn， generally showing a W trend. The metabolism correlation between the nitrate nitrogen and protein nitrogen of Eucalyptus leaves was not significant. Comprehensive analysis showed that the dynamic changes of the total protein content in Eucalyptus leaves were consistent with those of vegetative growth of trees， which could be used as an important indicator of fertilizer dressing for Eucalyptus. The nitrogen compounds needed for growth of Eucalyptus in Spring may be mainly due to the accumulation of storage proteins and the nitrate nitrogen in the leaves in a dormancy period of winter.

Keywords Eucalyptus ； storage protein ； nitrate nitrogen ； nitrogen metabolism

桉樹是常綠闊葉樹種，樹干通直，具有適應性強、生長迅速、輪伐期短等特點。因桉樹用途廣泛、經(jīng)濟效益高而在中國南方地區(qū)被大面積密集種植，成為農(nóng)民增收的一條重要途徑，對中國的經(jīng)濟發(fā)展起到巨大的促進作用[1-2]。然而廣西桉樹種植區(qū)的土壤養(yǎng)分含量相對比較貧瘠[3]，難以滿足桉樹快速生長對營養(yǎng)的需要。樹木需求量最大的礦質(zhì)營養(yǎng)元素是氮素，樹木根系吸收的氮化物在樹體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和重復利用對提高營養(yǎng)氮素的利用率具有決定性影響[4-5]。營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)（VSP）是氮素在樹木營養(yǎng)器官中儲存的主要形式[6-7]。研究桉樹葉片蛋白質(zhì)和硝態(tài)氮的年動態(tài)變化規(guī)律，對桉樹營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)的研究和利用有重要意義。目前關(guān)于桉樹的栽培和管理技術(shù)方面的研究報道不少，主要針對不同土壤類型、不同桉樹種類和不同肥料種類的施肥效應的研究[8-9]。陳少雄等[10]對尾葉桉的施肥結(jié)果表明，施用單一肥或2種元素的復合肥比N、P、K復合肥效果差，不施肥結(jié)果和只施N肥的效果相近。周寬[11]發(fā)現(xiàn)，不同的施肥處理方式，對桉樹樹高的影響并不是很明顯。這表明，氮素營養(yǎng)在桉樹生長過程中起到非常重要的作用。硝態(tài)氮可作為信號物質(zhì)來調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育，樹木營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)的積累和降解與硝態(tài)氮的吸收轉(zhuǎn)運、同化及再利用密切相關(guān)。目前關(guān)于桉樹葉片氮素積累與降解的調(diào)節(jié)機制和營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)的變化規(guī)律，以及蛋白質(zhì)與硝態(tài)氮代謝相關(guān)性的研究少有報道。因此，研究桉樹氮素積累與降解的調(diào)節(jié)機制和貯藏蛋白質(zhì)的變化規(guī)律，探討蛋白質(zhì)與硝態(tài)氮代謝相關(guān)性，可為指導人工林合理施肥和培育高氮利用率優(yōu)良品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗采用的材料來源于玉林師范學院東校區(qū)的廣林九號桉。選取無病蟲害、生長健壯的植株，采集2016年1～12月的桉樹一年生枝葉，每月中旬采集一次；用袋子封裝好貼上標簽保存在超低溫冰箱中，待用于各項指標的測定分析。

1.2 方法

1.2.1 蛋白質(zhì)的測定

采用考馬斯亮藍法[12]。稱取葉片0.5 g，加入Tris-HCl緩沖液（pH 7.8）5 mL和少許石英砂，冰浴研磨成漿，將勻漿倒入10 mL離心管，在13 000×g、4℃條件下離心40 min，棄沉淀取上清液，按Lowry-Folin 方法進行蛋白質(zhì)測定，將上述提取液適當稀釋，取2支試管，分別加入樣液1.00 mL；再分別精確加入1.00 mL 的ABC混合試劑，充分搖勻，于室溫靜置15 min； 然后在每只試管中分別準確加入3.00 mL Folin-酚試劑稀釋液，立刻震蕩，充分搖勻；靜置30 min后，于540 nm波長下分別測定試管中溶液的吸光度。

1.2.2 硝態(tài)氮的測定

采用水楊酸硝化法[12]。取一定量的桉樹葉片剪碎混勻后，精確稱取2 g，放入刻度試管中，量取10 mL無離子水加入試管，用塞子封口，置于沸水浴中提取30 min后用冷水冷卻；將提取液過濾到25 mL容量瓶中，并用無離子水反復沖洗殘渣，加入沖洗液定容至刻度；測定樣品中硝態(tài)氮含量時，用移液管吸取0.1 mL樣液分別加入3支試管中，然后分別加入0.4 mL 5%的水楊酸-硫酸溶液，混勻后置室溫下20 min；再緩慢加入8% NaOH溶液 9.5 mL，冷卻到室溫，于410 nm處測其吸光度。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Word、Excel和SAS 8.01統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，差異的顯著性檢驗采用Duncan氏法處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 總蛋白質(zhì)含量的年動態(tài)變化規(guī)律

由圖1可以看出，速生桉樹葉片總蛋白質(zhì)含量隨季節(jié)發(fā)生規(guī)律性的變化，一年中總蛋白質(zhì)含量先下降后上升，至7月份后又開始下降，總體呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢。1～3月份蛋白質(zhì)含量下降最快，到3月份下降至一年中最低，下降了57.3%，這個時期桉樹大量抽生新梢，快速生長需要分解大量的貯藏蛋白質(zhì)。3～7月份蛋白質(zhì)含量逐漸上升，積累速度較慢，到夏季7月份時桉樹葉片蛋白質(zhì)含量開始逐漸下降，9月份有所上升但隨后又下降，至12月份下降至最低，此時與3月份相比較略高一點。2016年1月份的葉片蛋白質(zhì)積累量達到一年中最大值，可能是因為玉林冬季12月和次年1月平均氣溫最低，這個時期桉樹基本停止生長，貯藏蛋白質(zhì)在這個時期快速積累，至第二年1月份達到最大值。

對2016年12個月的桉樹葉片總蛋白質(zhì)含量進行多重比較和方差分析，結(jié)果（圖1）表明，1月份和其他月份相比，蛋白質(zhì)含量差異達到極顯著水平。綜合比較4、5、6、8、9、10、11、12月份可知，蛋白質(zhì)含量差異并不顯著，但是與7月份相比，差異達顯著水平（p<0.05）。3月份到12月份，桉樹葉片總蛋白質(zhì)含量變化并不大，在1.728～2.242 μg/mg FW波動。

綜合分析認為，早春氣溫比較低，根系的吸收能力較弱，從土壤中吸收的營養(yǎng)物質(zhì)不能滿足樹木生長需要，此階段桉樹葉片總蛋白質(zhì)含量和硝態(tài)氮含量急驟下降，表明早春桉樹生長所需的氮素營養(yǎng)物質(zhì)主要由樹體自身的貯藏氮化物提供。3月份到12月份，桉樹葉片總蛋白質(zhì)含量變化非常小，總體呈波浪型變動，在8、9、10月份蛋白質(zhì)含量呈上升-下降的變化趨勢，10月以后都呈下降趨勢，這種變化趨勢，與王改萍等[13]研究得出的銀杏葉片中蛋白質(zhì)含量變化規(guī)律相似，不同的是至12月中旬銀杏葉片蛋白質(zhì)含量幾乎降為零，而桉樹葉片蛋白質(zhì)含量至初冬時降到與5月份幾乎持平，出現(xiàn)這樣的結(jié)果，可能是落葉樹種與常綠樹種不同的原因。葉片在脫落前是否已經(jīng)將蛋白質(zhì)降解轉(zhuǎn)移到樹體的其他組織中有待深入研究。

2.2 硝態(tài)氮含量的動態(tài)變化特征

由圖2可以看出，桉樹葉片硝態(tài)氮含量具有季節(jié)性的變化規(guī)律，冬季和春季時期硝態(tài)氮含量下降，至4月份開始上升，到6月份后又開始下降，秋季時期上升，總體上呈一個“W”字型的變化趨勢。12月至4月份桉樹葉片硝態(tài)氮含量逐月下降，下降到一年中最低，只有0.438 mg/g FW，與12月份相比，下降了66.9%。進入夏季的時候硝態(tài)氮含量先上升，隨后下降，上升量和下降量相差3.9%，整體變化量很小。秋季時期葉片開始逐漸積累硝態(tài)氮，其中9月到10月份積累速度最快，到12月份達到一年中最大值，為1.324 mg/g FW，與7月份相比，增長了65.6%。2016年桉樹葉片硝態(tài)氮含量在0.438～1.324 mg/g FW波動。

對桉樹葉片12個月份的硝態(tài)氮含量進行方差分析及多重比較，結(jié)果（圖2）表明，2016年中桉樹葉片硝態(tài)氮含量差異達到顯著水平（F=151.91，p<0.000 1）。綜合比較5月份與7月份，硝態(tài)氮含量不存在顯著差異，10月份與11月份也沒有達到顯著差異水平，但與其他月份相比都達到顯著差異水平。12月份與5、7月份比較，硝態(tài)氮含量差異達到極顯著水平。

2.3 硝態(tài)氮和蛋白態(tài)氮代謝的相關(guān)性分析

桉樹葉片中硝態(tài)氮和蛋白質(zhì)代謝的相關(guān)性如圖3所示。1～6月份變化趨勢基本相同，都是先下降后上升，不同的是蛋白質(zhì)含量在3月份后開始上升，而硝態(tài)氮在4月份開始上升，這個時期桉樹抽生新葉，蛋白質(zhì)和硝態(tài)氮都被轉(zhuǎn)運降解，當硝態(tài)氮供應充足時，多余的硝態(tài)氮被還原，用于合成貯藏蛋白質(zhì)或其他氮化物積累在某些特定的組織中，所以蛋白質(zhì)先于硝態(tài)氮增加。總蛋白質(zhì)含量上升到7月份后開始下降，硝態(tài)氮含量上升到6月份開始下降。夏季和秋季期間蛋白質(zhì)含量有微小波動，整體呈緩慢下降趨勢，而硝態(tài)氮含量從7月份開始快速積累，到12月份積累到最大量。從葉片總蛋白質(zhì)和硝態(tài)氮含量的整體變化趨勢來看，速生桉樹葉片硝態(tài)氮與蛋白質(zhì)氮代謝的相關(guān)性并不顯著。

3 討論與結(jié)論

桉樹為常綠樹種，生長速度快，除了冬季短暫的休眠期外，桉樹的生物量都在增加。初春時期桉樹枝條和葉片蛋白質(zhì)含量都處在一個比較高的水平，這是冬季休眠時期積累的營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)儲存在枝葉中，為春季桉樹的生長提供營養(yǎng)需要[14]。初春時期，桉樹開始長出新葉、新梢，需要大量營養(yǎng)物質(zhì)，特別是氮素，但是早春時期，氣溫比較低，光照強度不大，葉片的光合作用較弱，有機物合成量少，而根系的吸收能力未恢復，因此早春桉樹生長所需的氮素營養(yǎng)物質(zhì)只能由樹體自身的貯藏氮化物提供。隨著新葉的生長，樹體光合作用增強 ，根系從土壤中吸收礦質(zhì)養(yǎng)分運輸至葉片，開始積累營養(yǎng)物質(zhì)，3月中旬后蛋白質(zhì)含量和硝態(tài)氮含量開始上升。葉片蛋白質(zhì)含量積累到7月份后有微小波動，先下降后上升再下降，至12月降到最低。趙成帥[15]在棗樹營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)的細胞學研究中，結(jié)果表明枝條中營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)的變化規(guī)律與其新梢的生長呈現(xiàn)相反的變化趨勢，新梢生長階段蛋白質(zhì)降解，落葉期積累，落葉期間葉片中的營養(yǎng)貯藏蛋白質(zhì)降解，營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)移到枝條內(nèi)貯藏，減少養(yǎng)分的流失。本實驗與趙成帥研究結(jié)果較為一致，只是棗樹是落葉樹種，葉片中的蛋白質(zhì)含量變化比較大，而桉樹是常綠樹種，變化幅度小一些，這表明常綠樹木較落葉樹木中蛋白質(zhì)含量的季節(jié)性變化不明顯， 但仍然表現(xiàn)出類似的蛋白質(zhì)含量季節(jié)性波動。

葉肉細胞液泡是一個可以高濃度貯存硝態(tài)氮的場所，葉肉細胞中存在還原硝酸鹽的酶系，硝態(tài)氮可以在葉肉細胞中被還原成銨態(tài)氮供植物所利用。1～4月份，桉樹葉片硝態(tài)氮含量下降趨勢明顯。有研究表明，溫度的改變會影響植物對硝態(tài)氮的吸收，與3℃相比，30℃時植物對硝態(tài)氮的吸收顯著增強[16]。初春土壤溫度較低，抑制了根系吸收營養(yǎng)的能力，植物從土壤中吸收的硝態(tài)氮在根組織中大部分被還原，以供枝干生長；隨著光照強度增加，葉肉細胞中的硝酸還原酶活性增強，將硝態(tài)氮還原為銨態(tài)氮，所以葉片中硝態(tài)氮含量不斷減少。4月份時氣溫變得較高，根系吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力得到恢復，根系吸收硝態(tài)氮的量增多，向枝葉運輸硝態(tài)氮的量增多，所以4月份到6月份葉片中的硝態(tài)氮含量逐漸增加。6月份和7月份桉樹生長最為快速，樹體的各個生理機能較強，合成有機物增多，需要的氮化物增多，硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為最終產(chǎn)物氨基酸，用于合成蛋白質(zhì)，所以葉片的硝態(tài)氮含量減少而蛋白質(zhì)含量增多。值得注意的是葉片總蛋白質(zhì)含量在9月份后開始逐漸下降，也就是在秋季和初冬時期，桉樹的貯藏氮化物在緩慢降解，而同時期的硝態(tài)氮含量卻在不斷積累。有研究認為，氮素在新梢停止活躍生長時開始回撤，葉片中的蛋白質(zhì)降解向樹體回撤的氮，主要貯藏在枝條和根組織中[17]。所以在秋季葉片開始衰老時，葉片中的蛋白質(zhì)含量減少，而枝條的蛋白質(zhì)逐漸增加，此時根系還能從土壤中吸收硝態(tài)氮，但葉片的蛋白質(zhì)已經(jīng)不再積累而是降解，轉(zhuǎn)運到葉片的硝態(tài)氮沒有被轉(zhuǎn)化而在葉片中大量積累。

本研究對桉樹葉片蛋白質(zhì)和硝態(tài)氮的動態(tài)規(guī)律進行探討，發(fā)現(xiàn)葉片蛋白質(zhì)含量的年動態(tài)變化規(guī)律與樹木自身的生長習性相一致，這說明葉片的總蛋白質(zhì)含量變化是診斷桉樹內(nèi)部氮素營養(yǎng)狀況的一個重要指標，桉樹葉內(nèi)的蛋白質(zhì)水平在一定程度上可作為合理施肥的參考依據(jù)。總的來說，本研究僅探討了葉片蛋白質(zhì)和硝態(tài)氮的動態(tài)變化，在一定程度上豐富了桉樹氮素營養(yǎng)代謝的基礎理論研究，但尚未能直接科學地反映桉樹貯藏蛋白質(zhì)的變化規(guī)律，若要對桉樹人工林的氮素養(yǎng)分管理提出科學的指導，仍需從不同的方向做大量深入研究。

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