土壤微生物多樣性研究方法及其在土傳病害防治中的應用展望

周登博 井濤 陳宇豐 馮仁軍 起登鳳 張妙宜 謝江輝

摘 要 土壤質量是影響植物生長的關鍵因子，土壤微生物是評價土壤質量的重要指標，土壤微生物種群多樣性及優勢菌屬的變化，可以在一定程度上反映出土壤質量隨環境的變化過程。因此，系統研究土壤微生物的多樣性，不僅是防控植物土傳病害的關鍵環節，還是改良土壤質量的重要內容。本文綜述了土壤微生物多樣性的主要研究方法，包括傳統生物化學、現代分子生物學技術以及高通量測序方法等，闡述了各種方法的應用原理、優缺點。從土壤微生態平衡的角度，對土壤微生物多樣性研究在土傳病害防控中的應用進行展望，提出新的研究內容與思路，以便更好地應用于土傳病害微生態調控。

關鍵詞 土壤 ；微生物多樣性 ；生物化學技術 ；分子生物學技術

中圖分類號 S154 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.016

Abstract Soil quality is a key factor affecting the growth of a plant， and soil microbes are a key index for evaluation of the soil quality. The change of microbial population diversity and dominant species can reflect to some extent the change of soil quality with the environment. So， systematic research on the diversity of soil microbes is a key step of the control of soil borne diseases and an important subject to improve the soil quality. The main research methods for soil microbial diversity were reviewed， including traditional biochemistry， modern molecular biology techniques and high throughput sequencing method， and the principles， advantages and disadvantages of each method were described. From the aspect of the ecological balance of soil microbes， a prospect was made for the application of soil microbial diversity in the control of soil-borne diseases， and some new ideas for research were put forward in order to conduct micro ecological control of soil-borne diseases.

Keywords soils ； microbial diversity ； biochemical technology ； molecular biology

土壤中生活著數量龐大的微生物種群，這些種群包括細菌、真菌、放線菌等，直接參與土壤的生物生化過程，調節土壤生態系統中碳、氮、磷、鉀、鈣等重要元素的物質循環[1]，同時還承擔有機養分的分解轉化、土壤環境污染物凈化等多種生態功能[2]，在生態系統中起著舉足輕重的作用。由于土壤微生物對環境變化非常敏感，已成為評價土壤養分及生態質量變化最具潛力的生物指標之一[3]。近年來，通過研究香蕉枯萎病的發生、擴展、蔓延、防控，發現對于土傳真菌性病害，可通過微生物制劑及菌肥、有機肥、輪作等措施，改良土壤微生物群體結構，有效抑制土傳病害病原菌的繁殖，達到控制病害的目的。然而，有關土壤微生物群落多樣性的研究往往費時費力，且不能全面、準確地反映土壤微生物狀況。一方面是由于用于種類測定的方法和技術體系尚不成熟，如常規的分離培養反映的只是1%可以被分離培養的微生物；另一方面是由于土壤微生物對環境變化的敏感性，微生物群落會隨著土壤環境的時空變化而變化[4]，給研究帶來諸多困擾。本文簡要介紹了目前國內外土壤微生物多樣性的研究方法，對其原理、優缺點進行闡述，并將改良土壤微生物的理念和技術帶入土傳真菌病害防控工作中，以期更好地應用于實踐生產。

1 土壤微生物多樣性概述

土壤微生物種類多，組成復雜[5]，與土壤物質循環及能量轉移轉化密切相關[6]，在生物地球化學循環（biogeochemical cycles，BGC）過程中起著至關重要的作用[7-8]，并對土壤中有機、無機養分的轉換產生重要的影響[9]。土壤微生物的多樣性主要包括遺傳多樣性、物種多樣性、結構多樣性和功能多樣性等。其中遺傳多樣性是指在基因水平上，土壤微生物不同種群遺傳信息和遺傳物質的差異；物種多樣性是指土壤微生態系統中物種的豐富度和均一度，其中包括可培養和不可培養2類，是反映多樣性最直觀的形式；結構多樣性是指土壤微生物在細胞組分變化上的多樣性，可直接導致土壤中微生物代謝水平的差異；功能多樣性是指土壤中特定的微生物種群所執行的功能差異，如對植物生長促生作用、營養的分解、轉化與傳遞等[10-11]。這四種多樣性從不同角度分析了土壤微生物的微生態情況，可根據研究目的，選擇1～2種角度并結合環境因子進行分析。土壤微生物研究范圍主要有土壤真菌、細菌、古細菌等。一般指受到人為或者自然干擾下，微生物的群落結構、優勢種群消長、生理代謝、遺傳變異與種群演替等規律。應用在土傳病害研究中，主要指受到病原菌侵染后土壤微生物系統呈現出的一系列變化。土壤微生物系統是一個動態變化的系統，是通過自身遺傳維持相對穩定的結構功能， 通過種群、代謝等變異應對外界干擾，共同構成土壤微生物系統對環境變化或干擾的抵抗力（resistance）和恢復力（resilience），維護土壤微生態系統的相對穩定狀態[12-13]。通常來說，一個具有多樣性與活性的微生物群落土壤往往具有較為豐富的土壤養分，這種土壤微生物群落結構，即可維護土壤生態系統的穩定性，也有利于提高土壤生態系統的緩沖能力。

2 土壤微生物多樣性的研究方法

目前，土壤微生物生態系統研究大多停留在特征定性描述階段，其定量表征研究處于剛剛起步發展階段。隨著土壤微生物多樣性研究的日益深入，研究方法也在不斷改進。主要包括傳統的微生物平板培養法、土壤微生物生物量測定法、群落水平生理代謝分析法、磷脂脂肪酸PLFA分析法、基于核酸PCR擴增基礎上的變性梯度凝膠電泳（DGGE）、末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）以及近些年發展起來的高通量和高分辨率的宏基因組學、環境轉錄組學等。因每一種方法均有優缺點，加之土壤微生物的復雜性，采用單一方法往往不能夠全面、準確地描述多樣性狀況[9-10]，對此，應盡可能結合多種方法展開研究。

2.1 傳統生物平板培養法

傳統的土壤微生物群落多樣性研究方法主要為平板培養法，是對土壤微生物進行分離培養后，通過微生物的生理生化特征或特定的表現型進行分析鑒定。但該方法限于人為限定的培養條件，無法全面地估算微生物群落多樣性，也難以定量描述土壤微生物的群落結構。據估計，每克土壤約有4×103～4×104種細菌[14]，而全球僅細菌種類就達20萬～50萬種[15-16]，且其中相當大一部分在實驗條件下難以培養[17]；有學者認為傳統的培養法僅能分離1%～10%土壤微生物[18]，甚至認為只能分離0.1%～1%土壤微生物[19-20]。此外，平板培養本身就是一個對微生物重新選擇的過程，其結果并不能全面反映原始土壤微生物群落結構。可見，傳統的培養技術難以客觀、正確地反映包括土壤中微生物種別、種群大小、動態變化等許多重要參數，只有與其他先進方法結合起來，才能較為客觀而全面地反映微生物多樣性的真實信息，如Torsvik等[21]發現熒光顯微計數精度就比傳統培養法計數高100～1 000倍。

2.2 土壤微生物生物量測定法

土壤微生物生物量是指土壤中體積小于5×103 μm3的生物總量，主要包括微生物碳、氮、磷[6，22]。土壤微生物生物量作為植物生長可利用的養分儲存庫，能敏感、及時地反映或預警土壤的變化，曾被用作綜合評價土壤質量及土壤微生物活性強度的重要指標。有研究表明，施用無機氮的同時加施高C/N比的秸稈，可提高土壤中無機態氮被同化的水平，并通過土壤微生物生物量的固定，降低無機態氮淋失和揮發損失，進而提高氮肥的利用效率[23]。此外，土壤微生物生物量的變化還受植物生長狀況、溫度和濕度等環境因素的影響[24-28]。

土壤微生物生物量測定法主要包括直接鏡檢法、ATP分析法、底物誘導呼吸法、熏蒸培養法、熏蒸提取法。直接鏡檢法雖然較為原始，但作為最直接的土壤微生物量測定法，得到了廣泛應用。其主要缺陷為一是技術難度大，易產生較大誤差；二是操作復雜，要對不同種類微生物的個體大小進行測定，因此不適宜大批量樣品的測定。ATP分析法的基本原理為：微生物的細胞受到外來物質破壞后，用合適的溶劑提取，采用熒光素-熒光素酶法測定提取液的ATP含量，最后換算成土壤微生物量。其缺點表現為：一，目前常用的三氯乙酸法[29]，ATP的提取率較低；二，土壤質地差異越大，微生物ATP含量有可能也隨之變大，需要重新測定土壤微生物量和ATP之間的轉換系數[30]；三，土壤磷素狀況影響ATP測定的結果；四，費用昂貴、程序復雜，影響了方法的普及[29]。底物誘導呼吸法是基于由葡萄糖誘發的土壤最大呼吸率與土壤微生物量間的良好線性關系，通過底物（葡萄糖）誘導活的微生物呼吸放出CO2的量來間接測定微生物量。但是該方法容易受土壤含水量及酸堿度的影響。1976年，Jenkinso等[31]提出了熏蒸培養法，該法是根據被殺死的土壤微生物細胞因礦化作用而釋放CO2的量激增來測定土壤微生物量，操作簡單，誤差小，適于常規分析。但該法存在一些弊端，如培養時間較長、不適用于強酸性土壤等。1985年，在熏蒸培養法的基礎上提出了熏蒸浸提法，利用不同的浸提劑，通過氧化滴定法來測定土壤浸提液中可溶性有機碳含量，并依據與微生物量之間存在較穩定的比例關系，計算微生物量，該方法克服了熏蒸培養法及其它幾種方法的局限，成為目前應用比較多的微生物量測定方法。

2.3 群落水平生理代謝分析法

群落水平生理代謝分析法是利用微生物對單一碳源吸收利用能力差異來區分不同微生物群落的方法，已經發展了幾十年。早在1980年美國BIOLOG公司就生產出了BIOLOG微平板用于識別單一微生物群體。BIOLOG微平板主要有GN板、GP板、ECO板等，分別應用于革蘭氏陰性好氧菌、革蘭氏陽性好氧菌、微生物群落的特性分析。這幾類板的研究對象主要為生長速度相對較快的好氧型微生物類群[32]。在微生物生態研究中應用最多的為ECO板[33]。BIOLOG微平板的基本原理為，將不同碳源和四哇鹽染料裝于平板內的小孔，微生物在利用碳源時會產生自由電子，自由電子與染料反應產生顏色變化，因利用碳源的種類和程度不同，顏色也有深淺之分，由此表征微生物群落結構的差異[34]。GN板、GP板、ECO板分別為95、95、31種碳源，并含有1個空白對照孔（不加碳源）。每個平板3次重復，原始數據為各孔吸光度。該法需要每隔12或24 h讀數1次，連續讀數7 d。3次重復的數據可以直接進行顯著性分析。該法具有測定速度快，重復性高，系統性好等優點。

作為微生物群落水平上的生理特性分析法，目前BIOLOG微平板法已擴展到估算諸如碳源利用模式等微生物群落功能多樣性的研究[35-37]、不同土壤及植物根際土壤微生物群落差異性的研究[38-39]、植物內生細菌群落多樣性的研究[40]，以及轉基因植物或外源微生物對植物根際土壤微生物群落的影響[41-43]。但該方法也有其不足之處，一是BIOLOG微平板法所描述的只是土壤中生長代謝快或富營養型等少部分細菌群落的活性，不能全面反映微生物群落信息[33，44]，其測定的土壤微生物種類數量遠低于實際數量，甚至不到16S rDNA方法測定的微生物數量的1%；二是BIOLOG微平板中的碳源底物不能代表真實土壤中的碳源，因此它不能準確代表原生態系統中微生物的真實代謝多樣性[44]；此外，BIOLOG微平板的測定結果還會受到微孔板的類型、土壤稀釋液濃度以及稀釋液中干擾物質的影響等。為全面可靠獲得土壤微生物群落信息，可將BIOLOG微平板法與其它技術方法相結合起來使用。

2.4 磷脂脂肪酸（PLFA）分析法

磷脂約占細胞干重的5%，幾乎是所有生物細胞膜的重要組成成分[45]。由于磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid）只存在于活體細胞膜中，且不同的磷脂脂肪酸含量相對恒定，因此它適用于評價微生物群落的多樣性及監測微生物群落的動態變化[46]。基本流程為，用適當的提取劑先將土壤中磷脂脂肪酸提取出來，經甲基化后用氣相色譜或氣質聯用檢測，得到PLFA圖譜，統計分析，即可判斷出土壤微生物群落的多樣性[47]。

目前，PLFA分析法被廣泛應用到土壤微生物群落多樣性和生物量的研究，如植被[48]、氣候與季節[49-50]、肥料[23，51]、耕作方式[52]、土地利用方式[24，44]、有機污染物[53-54]、重金屬污染[55]等。但PLFA分析法也存在不足之處。一是因不明確土壤中所有微生物的特征脂肪酸，PLFA方法不能用來分析土壤中部分單個菌株或種水平上的微生物；二是由于該法是利用標記過的脂肪酸來分析土壤微生物群落多樣性，標記若有變動，將造成群落估算出現偏差；三是在不同環境條件下，細菌和真菌均能產生不同類型的磷脂脂肪酸，環境的改變有可能引起脂肪酸類型的改變[56]；四是耗時長，成本高，在實際應用中往往會受到一定的限制[57]。

2.5 分子生物學方法

近年來，基于微生物群落總基因組DNA提取方法的改進，利用微生物DNA進行數量及種類分析的技術得到長足發展，如克隆文庫法、DNA雜交法、G+C含量法、基于聚合酶鏈式反應（PCR）的圖譜分析法等。以PCR圖譜為基礎的分析法能夠快速、批量比較多個樣品間的微生物組成及變化。該方法主要包括：變性/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）、單鏈構象多態性（SSCP）、限制片段長度多態性/擴增核糖體DNA限制性分析（RFLP/ARDRA）、末端標記限制片段長度多態性（T-RFLP）、隨機擴增多態性DNA/長引物隨機擴增多態性DNA/基于高重復序列的PCR分析（RAPD/ERIC-PCR/rep-PCR）、（自動）核糖體基因間隔區分析（RISA/ARISA）。其中末端限制片段長度多態性是20世紀末應用于環境微生物方面的新方法，是一項綜合運用PCR、DNA限制性酶切、熒光標記以及DNA序列自動分析的微生物群落分析方法，是通過測定特定核酸片段長度多態性來分析比較微生物群落的結構和功能[58]。具體操作如下：首先，獲得所測樣品的總DNA，以總DNA為模版，采用5端含有熒光標記的引物進行PCR擴增反應（常用的熒光引物有TET、HEX、6-FAM等），將擴增產物用合適的限制性內切酶進行消化，由于不同菌種的酶切位點不同，因此會產生長度不一的多種限制性酶切片段。采用DNA自動測序儀檢測消化產物，獲得峰值圖。由于一種菌的末端帶熒光標記片段（T-RF）長度是唯一的，且不同長度的T-RF片段均可被檢測到，所以峰值圖中每一個峰至少代表了一種菌[59-60]。測定結果是以峰的高度和面積表示微生物的種類和數量，以此反映待測微生物群落的組成及時空變化[61]。T-RFLP方法具有以下優點：（1）高通量。用于微生物的時空演替研究時，可以在短時間內產生大量精確、可重復的數據；（2）由于用于片段分析的軟件已經提前設定好，可以快速標準化的統計分析數據，數據輸出為表格形式，避免指紋圖譜再數字化的程序；（3）通過與已知數據庫中的T-RF片段比對，既能定性定量分析，又可直接鑒定到種；（4）精確度、分辨度高[51]；（5） 操作簡單、實驗周期短，工作量大為減少。因此，T-RFLP技術已被廣泛用于分析各種環境（如土壤、水樣、腸道等）微生物的群落結構及動態變化[10，62-65]。

然而該方法在實際應用中需要注意以下幾個問題：（1）樣品中微生物總DNA的提取和限制性內切酶的選擇至關重要，試驗前需根據試驗目的，對不同待測樣品的提取方法進行優化，以獲得較高純度的總DNA；（2）限制性內切酶的篩選是影響分析結果的關鍵因素，需綜合幾種酶切結果對多個圖譜進行分析，提高檢出效率。前期對常用幾種酶進行篩選時發現，MSPI內切酶更合適于土壤微生物總DNA的酶切；（3） T-RFLP技術在檢測片段時只檢測含有熒光的比較端，但一個T-RF可能對應著2個以上菌種，導致檢測的群落多樣性較低。盡管T-RFLP技術還有些不足，但仍是目前研究微生物群落結構最常用的分析方法之一[58]。

2.6 高通量測序技術

高通量測序又稱為“深度測序”或“下一代測序”技術，可實現一次性讀取幾十萬到幾百萬條DNA 分子序列，可對樣本進行全面細致分析。目前高通量測序平臺主要有：454 Life Sciences公司的焦磯酸測序平臺、Illumina Solexa的MiSeq和HiSeq測序平臺以及Helicos Heliscope TM和Pacific Biosciences推出的單分子測序技術。對于土壤微生物多樣性分析，以454焦磯酸測序平臺和Illumina Solexa 的MiSeq測序平臺應用最多。

454 Life Sciences公司檢測原理就是依靠生物發光進行DNA測序。即在PCR反應過程中通過 DNA 聚合酶、雙磷酸酶、熒光素酶的協同配合，實現每延伸一個堿基釋放一次光信號[66]，測序平臺通過對光信號獲取和相關計算，得到待測DNA的堿基序列，實現實時測定 DNA 序列的目的。優點是讀取片段長，可以對樣本的基因組進行全面測序，通量較高。缺點是連續單堿基重復區的判斷準確度不太高，價位偏高。

Illumina 公司的MiSeq測序平臺是基于Illumina Solexa技術的第二代高通量測序技術平臺，現已成為環境微生物研究的主要測序技術，原理與454 Life Sciences公司的基本一致，不同的是激發熒光信號的方式不是通過焦磷酸氧化熒光素，而是直接在 dNTP 上連接熒光基團和阻斷基團[61]，也就是將小片段DNA連接在固相上，通過橋式PCR擴增成單分子簇，達到所需模板量后，將帶有特異熒光堿基（dNTP）加入反應體系，進而激發dNTP上熒光基因。該方法的優點是檢測通量高、價格低；缺點是片段相對較短，序列質量不穩定，有閱讀偏差，目前已成為土壤微生物研究的主要手段。

3 土壤微生物多樣性研究在土傳病害防治中的應用與展望

近幾十年來，中國農業迎來了突飛猛進的發展，作物產量和質量顯著提高，這歸功于農業科技的進步，但化肥農藥的過量施用，帶來了耕地質量下降，土傳病害頻發問題。在香蕉枯萎病田間調查中發現，土壤有機質豐富、pH值偏中性的土壤，枯萎病發生較輕，反之，枯萎病發生嚴重。通過對健康和發病土壤微生物進行比較，發現健康土壤微生物多樣性更豐富，特別是有益菌如芽孢桿菌、鏈霉菌相對數量較多，病原真菌的數量相對較少[67-68]。將環境因子與香蕉園土壤微生物做關聯分析發現，一些特定的營養元素如硼、鋅、磷等與枯萎病的發生有一定的相關性，但不同類型的土壤營養元素相關性卻不同。田間調查還發現，用殺真菌的藥劑進行枯萎病防治效果較差，用殺細菌藥劑處理后，枯萎病的發生明顯降低。這可能是由于枯萎病病原菌大量繁殖的同時引發特定種類細菌數量的增加，使用殺細菌藥劑在一定程度上降低細菌數量，與細菌數量有正相關關系病原真菌數量也將隨之降低。除枯萎病外，其他土傳病害中土壤微生物種類及多樣性與病害發生為何種關系，有待進一步探究。

可將中醫綜合調理理論應用于土傳病害防治，即從土壤、植物微生態系統平衡角度，構建有益微生物與病原菌之間的和諧平衡系統，同時增強植物本身的抗病性（免疫力）。但何為平衡的土壤微生物生態系統？如何構建健康的土壤微生物生態系統？不同作物種類、氣候條件、土壤類型，土壤微生物生態系統會有顯著不同，同時也會有一定的規律，即相同點。如何通過大量調查分析，總結出相同點與不同點，然后根據不同作物和土壤進行“號脈”、“抓藥”，有的放矢的對病害進行生態防控，已成為土傳病害防控亟要解決的首要問題。

土壤微生物群體龐大，由于研究目的、土壤環境、研究對象不同，會導致研究結果不同。要想更全面了解土壤微生物的多樣性，需將上述幾種研究方法結合起來使用。如：張秋芳等[69]為了解烤煙施肥技術對土壤微生物群落多樣性的影響，應用磷脂脂肪酸（PLFA）法，結合聚類分析，揭示土壤微生物群落功能的動態變化。張重義等[70]采用末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）技術和傳統平板培養的方法，研究地黃連作下根際土壤細菌群落的動態變化。張志紅等[67]采用 Biolog Eco 微平板和傳統平板培養的方法，研究不同肥料對土壤微生物功能多樣性影響。周登博[68]采用Biolog 和T-RFLP 的方法，探索了拮抗菌餅肥發酵液與土壤消毒劑對香蕉枯萎病的防控效果及對土壤微生物的影響。總之，不管采用何種研究方法，傳統分離培養法因可通過肉眼可見方式認識微生物資源的豐富性，成為土壤微生物研究不可或缺的方法之一，同時現代分子生物學的發展也為揭示土壤微生物奧秘的提供了新途徑。然而土壤微生物環境的復雜性決定了目前并不能準確了解土壤中到底存在多少微生物？尤其是特定微生物種群的具體數量。當前土壤微生物研究也只是局限在植物、微生物、土壤之間的互作，將物理、生化因素作為系統研究較少。因此，土壤微生物研究方法還需不斷改進和創新。而土壤微生物種群的多樣性是土壤性狀最重要的組成部分之一，因此，在大力倡導化肥農藥減施增效的大背景下，通過正確合理措施，如施用微生物菌肥、菌劑、有機肥替代部分化肥，調節和改善土壤的微生物生態結構和多樣性，必定將成為未來有機農業的重要發展方向之一。

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