利拉魯肽對匹羅卡品致癇大鼠海馬各區神經元凋亡的影響

王瑞芳　　薛國芳　　連霞　　高慧中　曹麗君　鄭輯英

[摘要] 目的 探討利拉魯肽對大鼠癲癇持續狀態后海馬各區神經元凋亡的影響。 方法 將雄性SD大鼠（n=54）隨機分為空白對照組（n=6）、匹羅卡品模型組（SE組，n=24）、利拉魯肽干預組（Liraglutide組，n=24）；并根據發作終止后的時間點（12 h，1 d，3 d，7 d）將SE組和Liraglutide組各分為4個亞組（n=6）。采用免疫組化技術檢測海馬CA3和DG區BCL2和BAX蛋白的表達。 結果 與SE組相比，Liraglutide組在SE后12 h、1 d、3 d時CA3區BCL2表達水平升高（P<0.05），而在SE后7 d時BCL2水平與SE組無差異（P>0.05）；在DG區，Liraglutide組在SE后1 d BCL2表達升高（P<0.05），在SE后3 d時表達無差異（P>0.05）。Liraglutide組相較SE組，在SE后12 h，DG區BAX表達開始明顯降低（P<0.01）；在SE后1 d，CA3區BAX表達降低（P<0.01）；且在SE后3 d，Liraglutide組DG區和CA3區BAX表達都高于空白對照組（P<0.05）。 結論 利拉魯肽通過抑制癲癇持續狀態后海馬CA3區和DG區神經元凋亡發揮神經保護作用。

[關鍵詞] GLP-1；癲癇；海馬；凋亡

[中圖分類號] R742.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）10-0032-05

Effects of liraglutide on neuronal apoptosis in each zone of hippocampus in rats with epilepsy induced by pilocarpine

WANG Ruifang1 XUE Guofang2 LIAN Xia2 GAO Huizhong2 CAO Lijun2 ZHENG Jiying2

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030000，China；2.Department of Neurology，Shanxi Medical University Second Hospital，Taiyuan 030000，China

[Abstract] Objective To investigate the effect of liraglutide on neuronal apoptosis in each zone of hippocampus after persistent state of epilepsy in rats. Methods Male SD rats（n=54） were randomly divided into blank control group（n=6）， pilocarpine model group （SE group， n=24）， and liraglutide intervention group（Liraglutide group， n=24）； the SE group and liraglutide group were divided into 4 subgroups（n=6） according to the time point after the termination of attack（12 h， 1 d， 3 d， 7 d）. Immunohistochemistry was used to detect the expression of BCL2 and BAX proteins in CA3 and DG zones of hippocampus. Results In the liraglutide group， compared with the SE group， the expression of BCL2 in CA3 zone was increased at 12 hours， 1 day and 3 days after SE（P<0.05）. However， there was no difference in BCL2 level compared with SE group at 7 days after SE（P>0.05）；in the DG zone， BCL2 expression was increased in liraglutide group one day after SE（P<0.05）；there was no difference in expression at 3 days after SE（P>0.05）. In the liraglutide group， the expression of BAX was significantly decreased in DG zone at 12 hours after SE compared with SE group（P<0.01）；one day after SE， the expression of BAX was decreased in CA3 zone（P<0.01）；and 3 days after SE， BAX expression in DG zone and CA3 zone in liraglutide group was higher than that in the blank control group（P<0.05）. Conclusion Liraglutide exerts neuroprotective effect by inhibiting apoptosis of neurons in CA3 and DG zones of hippocampus after persistent states of epilepsy.

[Key words] GLP-1；Epilepsy；Hippocampus；Apoptosis

癲癇持續狀態（status epilepticus，SE）是神經內科急癥，具有較高的致殘率和致死率[1，2]。但目前現有的抗癲癇藥，如苯二氮類藥物地西泮等僅可緩解癇性發作癥狀，并不能針對SE后癲癇發生發揮作用[3-5]。且SE可能發展為慢性癲癇，甚至難治性癲癇，預后較差[5]。因此，探討癲癇發生（Epileptogenesis）的機制并尋找能針對癲癇發生的用藥成為研究熱點。利拉魯肽是一種胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-like petide 1，GLP-1）類似物，目前被用于臨床2型糖尿病的治療[6]。近來研究表明，GLP-1類似物能夠穿過血腦屏障與腦內GLP-1受體結合，抑制腦內炎性反應、氧化應激、細胞凋亡等病理過程并增強突觸可塑性和海馬神經元再生，延緩神經系統疾病的發生發展[7，8]。其神經保護作用已在帕金森病（Parkinson's disease，PD）、阿爾茨海默病（Alzheimers disease，PD）、創傷性腦損傷、卒中的動物模型中得到證實；而且GLP-1類似物艾塞那肽對PD的研究已經在臨床上得到初步認證[9-12]。因此，本文采用氯化鋰-匹羅卡品模型模擬人類顳葉癲癇，觀察利拉魯肽是否能通過抑制SE后海馬各區神經元凋亡，發揮神經保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物與實驗分組設計

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，重200～250 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。將54只SD大鼠隨機分為三組：空白對照組（n=6）、匹羅卡品模型組（SE組，n=24）和利拉魯肽干預組（Liraglutide組，n=24）；并根據癇性發作終止后的時間點（12 h，1 d，3 d，7 d）將SE組和Liraglutide組各分為4個亞組（n=6）。Liraglutide組在癇性發作終止后腹腔注射利拉魯肽25 nmol/（kg·d）；SE組同時注射等體積生理鹽水。基于模型的成功率和死亡率，補充實驗大鼠，保證每組動物數量。

1.2 匹羅卡品誘導SE模型

SD大鼠首先按127 mg/kg腹腔注射氯化鋰（Sigma-Aldrich），20 h后腹腔給予1 mg/kg硫酸阿托品（天津金耀）來降低外周膽堿能反應，30 min后再給予30 mg/kg鹽酸匹羅卡品（MedChem Express）誘導癇性發作。觀察大鼠行為學變化，一般在鹽酸匹羅卡品注射后30 min內出現癇性發作。Racine分級標準（Racine分級：Ⅳ級：后肢站立伴全身強直性陣攣；Ⅴ級：站立伴摔倒的全身強直性陣攣發作），Ⅳ級及以上持續發作超過30 min認定為SE造模成功。SE后1 h，10 mg/kg地西泮（天津金耀）腹腔注射終止癇性發作。

1.3 免疫組織化學檢測海馬區BCL2和BAX蛋白表達

腹腔注射5%的水合氯醛（5 mL/kg）麻醉大鼠后，進行心臟灌注。打開胸腔，暴露心臟，將7#輸液器針頭從心尖部插入，同時剪開右心耳，快速灌入預冷生理鹽水約150 mL，待觀察到流出液變清亮時，停止灌注；隨后，用4%的多聚甲醛（PFA）先快后慢灌注約150 mL。待大鼠四肢、尾巴僵硬后斷頭取腦，并浸泡于4%PFA中固定。24 h后腦組織脫水、包埋、制作5 μm厚石蠟切片。切片經二甲苯、酒精脫蠟水化后，用3%的過氧化氫溶液室溫孵育10 min以滅活內源性的過氧化物酶。隨后，以檸檬酸鹽緩沖液（pH=6.0）進行抗原修復。一抗包括兔抗鼠anti-BCL2（1∶50，Bioworld technology），兔抗鼠anti-BAX（1∶50，Bioworld technology）分別4℃孵育過夜后，二抗-山羊抗兔IgG（1∶500，博士德）37℃孵育1 h。切片每次孵育后需用0.01 M的磷酸鹽緩沖液（PBS，博士德）洗滌3次，每次5 min。滴加辣根過氧化物酶標記的ABC復合物（中山金橋），37℃反應20 min。DAB室溫顯色約3 min后，自來水終止顯色。最后蘇木素浸染約1 min，鹽酸酒精分化1 s，流水沖洗返藍后脫水、封片。進行圖像分析，用Image pro plus 6.0分別進行海馬CA3、DG區陽性細胞計數。

1.4 統計學方法

采用SPSS20.0統計學軟件進行分析，計量資料經正態性檢驗，均符合正態分布，采用均數±標準差（x±s）描述。依據資料性質，多組均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1利拉魯肽增強海馬CA3和DG區BCL2表達水平

與空白對照組相比，SE組在SE后12 h海馬CA3區BCL2表達明顯升高（P<0.05），且在SE后1 d達到峰值（P<0.01）；DG區BCL2表達在SE后1 d開始升高（P<0.01），3 d后維持較高水平（P<0.01），7 d后BCL2表達仍高于空白對照組（P<0.05），但低于SE后3 d時的水平。與SE組相比，Liraglutide組在SE后12 h、1 d、3 d時海馬CA3區BCL2表達水平升高（P<0.05），而在SE后7 d時BCL2水平與SE組無明顯差異（P>0.05）；相較SE組，Liraglutide組在海馬DG區，SE后1 d BCL2表達升高（P<0.05），在SE后3 d時表達無明顯差異（P>0.05）。見圖1a（封三）、圖1b、圖2a（封三）、圖2b。

2.2利拉魯肽減低海馬CA3和DG區BAX表達水平

在SE后12 h，SE組海馬DG區BAX表達明顯高于空白對照組（P<0.01），且隨時間推移而逐漸增加（P<0.01）；海馬CA3區BAX表達在SE后1 d開始增加（P<0.01），且在3 d后達到峰值，7 d時仍維持較高水平。與SE組相比，Liraglutide組海馬DG區BAX水平在SE后12 h開始明顯降低（P<0.01），且與空白對照組無明顯差異（P>0.05）；在SE后3 d BAX表達仍低于SE組（P<0.01），且高于空白對照組（P<0.01）。相較SE組，Liraglutide組在SE后1 d海馬CA3區，BAX表達明顯降低（P<0.01），但與空白對照組無明顯差異（P>0.05）；在SE后3 d Liraglutide組BAX較SE組低但高于空白對照組（P<0.05）。見圖3a（封三）、圖3b、圖4a（封三）、圖4b。

3 討論

氯化鋰-匹羅卡品誘導的SE模型模擬人類顳葉癲癇，在SE后，進入1～2周的潛伏期（此時，SE誘導的腦損傷持續進展），最后可能發展為慢性癲癇[13，14]。研究表明，神經元凋亡在潛伏期癲癇發生過程中發揮重要作用，而氧化應激又是誘導凋亡最主要的原因[15，16]。SE誘導氧化應激，即ROS/RNS上調，其損害細胞膜蛋白、酶和線粒體；ROS/RNS觸發的線粒體DNA損傷及電子鏈功能失用被認為是神經元凋亡的主要因素；線粒體對于ROS/RNS的變化極為敏感，線粒體應激、功能障礙時，細胞內鈣離子增加，抗氧化物尤其是谷胱甘肽合成障礙、鈣離子依賴的線粒體滲透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開啟引起細胞凋亡[15，17，18]。既往研究顯示，這些應激反應均可增強突觸傳導、提高神經元興奮性，進一步促進癲癇發生[19]。因此，抑制神經元凋亡有可能抑制癲癇發生，延緩疾病進展。ROS產物與線粒體Ca2+共同作用開啟MPTP，導致促凋亡分子從線粒體釋放到胞漿，通過Caspase途徑、線粒體相關蛋白BCL2家族以及凋亡誘導因子（apoptosis-inducing factor，AIF）觸發細胞凋亡[20-23]。BCL2家族包括抗凋亡蛋白BCL2、BCL-XL和促凋亡蛋白BAX、BAD等，其主要通過調控BCL2/BAX含量比值發揮作用；當促凋亡蛋白BAX含量遠高于抗凋亡蛋白BCL2水平時，促進細胞色素C（Cytc）釋放，啟動線粒體凋亡[24]。所以，本實驗通過檢測SE后大鼠海馬各區BCL2和BAX蛋白的表達情況來探討利拉魯肽能否通過抑制神經元凋亡來發揮神經保護作用。

本實驗采用匹羅卡品模型，觀察SE后12 h、1 d、3 d、7 d這4個時間點海馬CA3區和DG區BCL2/BAX表達情況。結果顯示，BCL2表達在SE后12 h就開始明顯升高，但在CA3區其表達在1 d后又開始下降，在DG區BCL2表達在7 d后開始下降；海馬DG和CA3區BAX表達分別在SE后12 h和1 d開始升高，且持續維持較高水平。SE誘導促凋亡蛋白BAX在SE后12 h開始升高，使得MPTP開啟且線粒體外膜通透性增加、促凋亡分子釋放到胞漿，激活下游caspase依賴和非依賴性的凋亡通路，促進癲癇發生[25]。而抗凋亡蛋白BCL2在SE后也升高，可能是機體應激狀態的自我保護，但在SE后1 d就開始下降，使得BCL2/BAX含量比值下降，協同BAX促進癲癇發生。結果表明，在SE后癲癇發生過程中細胞凋亡持續存在，且繼續進展，這與之前的研究結果相一致，SE后BCL2家族迅速被激活，誘導線粒體途徑凋亡，并進一步討論了DG區凋亡情況的變化[16，26]。

有研究[27-29]認為，SE后潛伏期可能成為癲癇治療的重要時間窗，但現有抗癲癇藥并不能針對潛伏期間癲癇發生的病理過程發揮作用。因此，致力于癲癇發生的用藥研究成為熱點。研究表明，左乙拉西坦、α-細辛醚、西格列汀等可以通過抑制SE后神經炎性反應、細胞凋亡來作用于癲癇發生，從而發揮一定的神經保護作用[20，30，31]。神經元凋亡被認為是SE后促進癲癇發生的重要病理機制，而GLP-1受體激動劑在PD、AD模型中能有效抑制線粒體應激，抑制凋亡[32]。因此，本研究通過檢測利拉魯肽對SE后海馬CA3和DG區促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白BCL2的表達情況，表明利拉魯肽在SE后12 h開始發揮作用，但在SE后3 d時，Liraglutide組海馬DG區BCL2表達與SE組無統計學差異，BAX表達雖低于SE組卻高于空白對照組，表明利拉魯肽可能通過部分調整BCL2和BAX蛋白表達水平來緩解線粒體應激引起的細胞凋亡，但其對SE后細胞凋亡的抑制具有一定的局限，可能是由于癲癇發生過程的錯綜復雜性或者利拉魯肽藥物濃度降低所造成的，其機制尚不清楚，有待進一步的研究。

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（收稿日期：2017-11-25）