小麥幼胚離體培養初步研究

李思琪，孫 寧，崔馳浩

（天津農學院 農學與資源環境學院，天津 300384）

小麥為中國三大糧食作物之一，2012年總產量達到1.2億t左右，是中國半數以上人的主糧。隨著人民生活水平的提高，對小麥產量及品質有了更高的需求，因此，培育優良小麥品種，提高產量、改善品質等研究具有重要意義。利用轉基因技術將特定的外源基因導入小麥中，從而定向改良小麥品種，為小麥遺傳育種提供了一條新途徑，而建立高效的再生體系是小麥遺傳轉化的關鍵環節之一。研究表明，在篩選小麥離體培養再生體系時，幼胚是較好的試驗材料，且目前已獲得了再生小麥苗。有學者認為從小麥幼胚離體培養得到的小麥苗，其后代籽粒胚乳醇溶蛋白亞基和蛋白質含量均有變化，建立幼胚高效再生體系并進行遺傳轉化，可改良其品質。

本文以小麥品種遼春17幼胚為試材，對其進行離體培養研究，以獲得高頻高效的再生體系，為小麥的遺傳轉化研究提供技術基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

取遼春17開花后13～16 d的幼穗，剝離籽粒，用75%乙醇浸泡40～60 s，無菌水沖洗4～5次，再用0.1% HgCl2表面滅菌7.5 min，無菌水沖洗6～7次后，剝去幼胚，接種于愈傷組織誘導培養基上。

1.2 培養基

培養基均以MS為基本培養基，附加蔗糖30 g·L-1、0.7%瓊脂。其他成分見表1，調節pH值至5.8～6.0，120 ℃高壓滅菌20 min，幼胚愈傷組織分化培養基激素配比見表2。

表1 幼胚愈傷組織誘導與繼代培養基

表2 幼胚愈傷組織分化培養基激素配比

1.3 試驗方法

幼胚愈傷組織誘導于25 ℃黑暗條件下培養，15 d后選取色澤鮮艷且致密的胚性愈傷組織，繼代于愈傷組織繼代培養基中(15 d繼代1次)。分化培養采用光培養，光照強度2 000 Lx，光照時間為12 h·d-1，溫度為25 ℃。接種后10 d左右統計出愈外植體數，觀察并記錄愈傷組織的顏色及質地。轉入分化培養后實時觀察，統計產生綠點的愈傷組織及分化出綠芽的愈傷數。出愈率、分化率計算公式如下 ：

出愈率/%=出愈外植體數÷接種外植體數×100%

分化率/%=分化出綠芽的愈傷數÷接種愈傷數×100%

2 結果與分析

2.1 小麥幼胚愈傷組織的誘導

遼春17幼胚接種后4～6 d即可誘導產生愈傷組織，10 d左右不同激素處理的愈傷組織誘導率產生明顯差異。A組添加2,4-D（1 mg·L-1）、CH、Gln的處理平均出愈率高達93.8%，且出愈快，愈傷組織顏色鮮艷，致密，質量較好。添加VB1、麥草畏的兩組處理出愈率反而有所降低（表3）。其中A2：2,4-D 1 mg·L-1、CH 200 mg·L-1、Gln 200 mg·L-1處理出愈率最高，為98.0%，說明添加VB1和麥草畏不如單獨使用2,4-D（1 mg·L-1）、CH、Gln的效果好。

表3 小麥幼胚愈傷組織誘導試驗結果

2.2 不同激素處理對愈傷組織分化的影響

不同激素對幼胚愈傷組織的分化率影響較大。在添加NAA(0.5 mg·L-1)的基礎上，KT的促進效果明顯優于6-BA與TDZ，培養基中添加適量的KT會獲得較高的綠點率及分化率。其中D1處理的愈傷組織分化率最高為66.7%，而F1處理的組織分化率最低為35.4%（表4）。結果表明，MS培養基添加NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1為遼春17幼胚愈傷組織分化較為理想的培養基配方。

表4 幼胚愈傷組織分化培養結果

3 結論與討論

生長素2,4-D被廣泛應用于植物離體培養過程中促進細胞分裂與愈傷組織的獲得。近年來，麥草畏也在小麥、大麥、玉米等禾谷類植物研究中用于愈傷組織的誘導。試驗發現，在添加2,4-D 1 mg·L-1基礎上，添加麥草畏1～4 mg·L-1反而會使幼胚出愈率降低，說明不同小麥品種在選擇誘導愈傷組織形成的激素種類上有所不同。郭向云等研究表明，在小麥幼胚愈傷組織誘導、繼代和分化的培養基中添加VB1有利于胚性愈傷組織的發生，可降低非胚性愈傷組織的發生頻率，能顯著提高小麥幼胚愈傷組織的分化能力。但在試驗中發現添加VB1時小麥愈傷組織誘導率降低，因此，在今后研究中，應在保證高愈傷組織誘導率的基礎上篩選VB1使用的最適濃度。

胚源愈傷組織再分化是形成小麥幼胚愈傷組織再生植株的關鍵環節。林毅等研究發現，在適宜的培養條件下，分化率能達到99%；但大多研究結果證明，再生率在不同基因型之間表現出較大的差異，同時，分化率與外植體類型、外源激素種類均有很大的相關性。本試驗選用NAA與KT、6-BA、TDZ配合使用發現，NAA 0.5 mg·L-1與KT 1.0 mg·L-1配合使用分化率高達66.7%，與其他處理最低相差31.3%。

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