不同基因型煙草對大鼠脾組織凋亡相關蛋白表達的影響

杜 彬，魏克強

（山西大學生命科學學院，山西 太原 030006）

煙草的固有成分及其燃吸后釋放的化學物質決定了煙草煙氣化學成分的組成，因此，不同基因型煙草煙氣的化學成分具有明顯的差異[1-3]，煙氣暴露產生的毒理學效應也有所不同[4-6]。通過比較不同基因型煙草煙氣化學成分的體內毒理學效應，有助于指導“降毒減害”煙草品種的選育，這對提高卷煙制品的安全性具有重要意義。

煙草煙氣中包含的有害成分可通過肺組織進入循環系統，從而影響多組織器官[7]，引起水腫、壞死、凋亡等多種類型的細胞損傷[8-10]。細胞凋亡是一種受嚴格調控的細胞死亡方式[11]，Bcl-2蛋白家族成員Bcl-2與Bax是其重要的效應蛋白，二者的水平可影響細胞凋亡/抗凋亡的動態平衡[12]。細胞中的Bcl-2和Bax蛋白主要結合于線粒體膜表面，影響線粒體膜結構的穩定性，調節線粒體依賴性細胞凋亡[13]。近年來，有研究表明，煙草煙氣可影響細胞中Bcl-2家族蛋白的表達[14-15]。

脾臟作為人體最大的外周免疫器官，是淋巴細胞遷移、免疫應答以及抗體生成的重要場所[16]。長期吸煙將迫使脾臟反復接觸血液中的煙草煙氣有害成分，對脾組織造成損傷，引起免疫功能失常，嚴重威脅人體健康。ZHUO等[17]研究表明，煙草煙氣暴露可影響脾組織中細胞凋亡的趨勢，同時暗示這可能與Bcl-2家族蛋白有關。

本研究以2種基因型的煙草為試驗材料，通過單純全煙氣暴露法對SD大鼠進行染毒，通過檢測大鼠脾組織中Bcl-2和Bax的表達水平，從Bcl-2/Bax值入手分析煙草煙氣暴露對脾組織的影響，評價不同基因型煙草可能的毒理學效應。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

雄性SD大鼠購自軍事醫學科學院實驗動物中心；供試煙草品種T-1，T-2由山西農業大學煙草育種研究室提供，卷制成單料煙待用。

1.2 試劑

兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體購自Proteintech公司；兔抗大鼠Bax多克隆抗體購自上海生工生物工程股份有限公司；SABC免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙氣暴露動物毒理模型構建 將24只雄性清潔級SD大鼠隨機分為正常空氣暴露對照組（CK）和2個煙氣暴露處理組（T-1，T-2），每組 8只。參考文獻[6-8]中的方法，將SD大鼠置于有機玻璃染毒箱中，每次點燃10支香煙，煙霧泵入染毒箱并維持1 h，每天2次，間隔4 h，每周6 d，持續56 d；對照組正常空氣暴露。

1.3.2 脾組織采樣及處理 分別于染毒28，56 d各組隨機取4只大鼠，10 g/L戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉。解剖取脾組織，經常規方法制成石蠟包埋組織塊。

1.3.3 免疫組織化學染色法檢測脾組織Bcl-2和Bax的表達 常規石蠟切片、脫蠟至復水，SABC三步法檢測Bcl-2和Bax的表達，DAB顯色，蘇木精復染后中性樹膠封片鏡檢，100倍放大視野拍照，隨機選取5張通過Image Pro Plus 6.0分析圖像的積分光密度（Integral optical density，IOD），計算平均光密度，分析Bcl-2和Bax蛋白的表達量，進一步分析脾組織中Bcl-2/Bax值。

1.4 統計分析

使用SPSS 18.0進行統計學分析，所有數據以表示，多組間執行One-way ANOVA單因素方差分析和Duncan's差異顯著性檢測，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 煙氣暴露對脾組織Bcl-2和Bax表達的影響

由圖1和表1可知，染毒大鼠脾組織白髓（WP）和紅髓（RP）中的Bcl-2表達水平均明顯上升（P＜0.05），且T-2組WP的Bcl-2水平顯著高于T-1組（P＜0.05）；而在 RP中，染毒28 d時T-2組的表達水平顯著高于T-1組（P＜0.05），但56 d時T-1組的Bcl-2水平顯著高于T-2組（P＜0.05）。由圖2和表1可知，染毒大鼠WP的Bax表達均始終無明顯變化（P＞0.05），T-1與T-2組間也無顯著差異（P＞0.05）；而在 RP中，Bax的表達均明顯增加（P＜0.05），染毒28 d時T-1組顯著高于T-2組（P＜0.05），但56 d時T-1和T-2組間無明顯差異（P＞0.05）。結果表明，煙草煙氣暴露能刺激大鼠脾組織WP和RP中Bcl-2以及RP中Bax的表達，但對WP中Bax表達無明顯影響。T-1組Bcl-2和Bax表達水平的變化較T-2組更為明顯，說明不同基因型煙草對大鼠脾組織Bcl-2和Bax表達的影響存在明顯差異。

表1 煙氣暴露大鼠脾組織白髓及紅髓中 Bcl-2和Bax的表達水平（n＝4

表1 煙氣暴露大鼠脾組織白髓及紅髓中 Bcl-2和Bax的表達水平（n＝4

注：*表示與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；#表示試驗組間差異顯著（P＜0.05）。表2同。

處理CK T-1 T-2 CK T-1 T-2染毒時間/d 28脾白髓（WP） 脾紅髓（RP）56 Bcl-2 5.41±0.64 7.68±1.32*19.05±2.51*#5.03±0.22 8.96±1.87*13.75±2.1*#Bax 2.98±0.21 3.09±0.58 3.12±0.34 2.94±0.26 3.07±0.11 2.94±0.36 Bcl-2 5.91±1.03 12.42±2.32*23.94±3.82*#5.33±0.44 12.35±2.15*8.53±0.77*#Bax 2.37±0.14 4.85±0.27*3.73±0.26*#2.43±0.23 10.11±0.31*9.38±0.86*

2.2 煙草煙氣暴露對大鼠脾組織中Bcl-2/Bax值 的影響

表2 香煙煙霧暴露大鼠脾組織Bcl-2/Bax值（n＝8

表2 香煙煙霧暴露大鼠脾組織Bcl-2/Bax值（n＝8

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對Bcl-2/Bax值的分析表明，與對照組相比，試驗組大鼠WP中Bcl-2/Bax值均顯著上升（P＜0.05），且T-2組WP的水平顯著高于T-1組（P＜0.05）；雖然在染毒28 d時，T-2組RP的Bcl-2/Bax值明顯上升且顯著高于T-1組（P＜0.05），但染毒結束后T-1和T-2組均顯著低于對照組（P＜0.05），且 2個組間無顯著差異（P＞0.05）（表 2）。結果說明，煙氣暴露后脾組織不同結構的Bcl-2/Bax值有明顯差異，同時不同基因型煙草對脾組織Bcl-2/Bax值的影響也具有顯著差異。

3 討論

細胞凋亡是一種調節并維持正常細胞穩態的關鍵效應，受抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的調控，二者可與線粒體膜上的電壓依賴性離子通道相互作用影響細胞色素C依賴性細胞凋亡信號通路[18]，決定下游Caspase-3激活的與否[19-20]。同屬Bcl-2蛋白家族的Bcl-2與Bax在細胞中常以二聚體的形式存在并可相互作用，當Bcl-2與Bax水平處于動態平衡時，細胞中多為Bcl-2/Bax異源二聚體，二者動態平衡被打破后，細胞中Bcl-2或Bax同源二聚體增多，增強其抗凋亡或促凋亡作用，影響細胞凋亡趨勢[21-22]。因此，Bcl-2/Bax值能在一定程度上體現細胞中Bcl-2與Bax二聚體的水平，反映細胞凋亡的趨勢。

通過循環系統進入脾組織的煙草煙氣成分可影響細胞Bcl-2與Bax的表達，破壞Bcl-2與Bax之間的動態平衡，改變Bcl-2與Bax間相互作用及其同源或異源二聚體的水平，繼而影響脾組織的細胞凋亡[16]。本研究表明，不同基因型煙草煙氣暴露后，大鼠脾組織中Bcl-2和Bax水平發生不同程度的變化，導致脾組織細胞的Bcl-2/Bax動態平衡被打破。

NADZRI等[23]和PIEKARSKA等[24]的研究認為，Bcl-2/Bax值的上升可抑制細胞凋亡，導致細胞異常增殖、癌變和慢性炎癥等的發生；而Bcl-2/Bax值的下降可能使組織細胞凋亡增強，并造成一定的損傷。本研究中，大鼠脾白髓Bcl-2/Bax值顯著升高，表明細胞凋亡受到抑制，這一變化可延長白髓中炎癥細胞的壽命，導致異常炎癥反應的發生，在MANFREDI等[25]的研究中也有相似的發現。而大鼠脾紅髓Bcl-2/Bax值顯著降低，說明煙草煙氣可促進脾紅髓細胞凋亡并導致脾組織損傷。此外，T-1與T-2組大鼠脾組織中Bcl-2和Bax水平以及Bcl-2/Bax值間存在明顯差異，這可能是由于不同基因型煙草間化學成分不同，繼而對脾組織產生的影響不同。

綜上所述，煙草煙氣可刺激脾白髓細胞上調Bcl-2/Bax值，與異常炎癥的發生有關；而脾紅髓更易因煙草煙氣暴露而發生細胞凋亡，導致組織損傷。同時煙草基因型不同與脾組織Bcl-2，Bax表達及Bcl-2/Bax值的變化緊密相關，這可能與不同基因型煙草的化學成分存在差異有關。Bcl-2/Bax值一定程度反映了細胞凋亡的趨勢，有可能作為評價煙草體內毒理學效應的潛在指標。

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