谷子PT2基因保守序列的克隆與分析

李 燕，楊致榮，高建華

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)文理學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷 030801）

谷子（Setaria italica）又稱粟，是起源于我國的一種古老作物，也是我國過去幾千年來的主栽作物和中華民族的哺育作物。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高及食品多樣化和營養(yǎng)化，小米及其制品備受青睞。提高谷子產(chǎn)量和品質(zhì)也成為目前研究的熱點。

對于水稻（Oryza sativa）等糧食作物而言，覆蓋地膜[1]，噴施赤霉素[2]，不同氮肥組合和施肥方式[3]，提高籽粒大小、質(zhì)量，防止成熟后落粒，均是促進產(chǎn)量的有效手段。目前，已經(jīng)克隆出了多個籽粒性狀相關(guān)基因如 GL7[4]，GW8[5]，GW7[6]和 GW2[7]等；落粒相關(guān)基因，如 qSH1[8]，SHAT1[9]，SH4[10]，PT2[11]和 SH5[12]等。其中，水稻PT2（Panicle Traits 2）基因編碼蛋白，即生長調(diào)節(jié)因子Os GRF4（Growth Regulating Factor 4，Os02g47280）是擬南芥At GRF的同源蛋白。研究表明，Os GRF4能夠調(diào)節(jié)細胞分裂素脫氫酶前體基因（CKX5和CKX1），導(dǎo)致細胞分裂素含量提高，進而調(diào)節(jié)籽粒大小、形狀等。當(dāng)Os GRF4表達受到抑制后，離層發(fā)育良好，從而增強了落粒性；反之，若Os GRF4高效表達，離層發(fā)育不完全，落粒性減弱[13]。PT2基因的表達受到miRNA的調(diào)控，第3個外顯子中有一段miR396結(jié)合序列。當(dāng)OsmiR396結(jié)合該位點時，PT2基因的表達被抑制；該結(jié)合位點的突變，導(dǎo)致OsmiR396無法結(jié)合，從而使PT2基因的表達量升高[14-15]。另外，作為一種調(diào)節(jié)因子，Os GRF4蛋白具有與核酸和其他蛋白質(zhì)（比如，GRF-Interacting Factors，GIF）互作的結(jié)構(gòu)域——WRC和QLQ。其中，WRC幫助Os GRF4蛋白與核酸互作，QLQ協(xié)助Os GRF4與其他蛋白互作[14-15]。另外，水稻Os04g51190基因編碼序列與Os GRF4氨基酸序列同源性約70%，但目前未發(fā)現(xiàn)其與籽粒性狀或落粒相關(guān)。

在豫谷1號的基因組數(shù)據(jù)（Setaria italica v2.2）中，有2個PT2基因的同源基因（Seita.1G287100.1和Seita.7G224500.1）。初步分析發(fā)現(xiàn)，這2個基因均含有相應(yīng)的miR396結(jié)合序列，且其編碼多肽也具有WRC和QLQ結(jié)構(gòu)域。狗尾草（Setaria viridis）是谷子的近緣野生種，但二者在籽粒大小和落粒性等方面存在顯著差異。

為了研究PT2基因與谷子籽粒性狀及其落粒性的相關(guān)性，本研究首先分析了幾種植物PT2基因的親緣關(guān)系；預(yù)測了豫谷1號PT2基因啟動子序列中的相關(guān)元件，并驗證了PT2基因在豫谷1號不同部位的表達水平；篩選并比較了43種谷子和3種狗尾草中該基因的保守區(qū)域序列，旨在為后期篩選谷子落粒相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用到的谷子和狗尾草材料列于表1。所有材料均種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田。

表1 研究所用到的谷子和狗尾草種質(zhì)資源

1.2 方法

1.2.1 PT2基因及其啟動子的生物信息學(xué)分析從 phytozome網(wǎng)站（https://phytozome.jgi.doe.gov/）下載水稻PT2基因序列（LOC_Os02g47280），并下載擬南芥、水稻、谷子、狗尾草、高粱和玉米中與之同源性最高的基因序列。對這些基因編碼的氨基酸序列進行同源性分析，并利用MEGA 7.0分析其親緣關(guān)系。下載Seita.1G287100基因起始密碼子上游1 500 bp的序列，在 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子在線預(yù)測。然后，對谷子和狗尾草PT2基因的啟動子進行序列比對。

1.2.2 總RNA提取與PT2基因的檢測 使用TaKaRa總RNA提取試劑盒（MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，貨號 9769S），按照說明書提取豫谷1號苗和穗的總RNA。然后使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（TaKaRa，貨號RR047A）合成 cDNA。使用引物 579F（5′-CAGCGG CTTCCAGAACCACT）和 1179R（5′-GTTCGGCGAC TGAGAGCTTGCCA）檢測Seita.1G287100.1基因的表達。

1.2.3 植物基因組DNA的提取 谷子和狗尾草基因組DNA提取使用CTAB法：CTAB提取液（200 mmol/L Tris-Cl，250 mmol/L NaCl，25 mmol/L EDTA和0.5%SDS，pH值7.5）65℃預(yù)熱；在1.5 mL離心管中加入50mg幼嫩葉片，并加入500μLCTAB提取液，用高通量DNA研磨機（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號SCIENTZ-48）充分研磨；放入65℃水浴溫浴1 h，期間每隔5 min顛倒混勻；加入500 μL氯仿 /異戊醇（體積比 24∶1），振蕩混勻，室溫靜置10 min；12 000 r/min離心10 min，取上清至新離心管；加入等體積氯仿/異戊醇（體積比24∶1），混勻后12 000 r/min離心10 min；取上清至新離心管，并加入0.7倍體積預(yù)冷的異丙醇，混勻后放入-20℃1 h；取出后12 000 r/min離心10 min，棄上清，并用70%乙醇清洗沉淀2次；室溫晾干，加入30 μL ddH2O溶解DNA，最后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PT2基因外顯子的擴增及序列分析 根據(jù)數(shù)據(jù)庫中Seita.1G287100基因序列，設(shè)計2對特異性引物，用于分別擴增不同谷子或狗尾草中PT2基因的前3個外顯子序列。引物PT21-E12-F（5′-ACAAAGCGGGCAATAAAGGC）和PT21-E12-R（5′-ACACGGCAAGTATTCGGGAG）用于擴增外顯子1和 2。引物 PT21-E3-F（5′-GTAGCTGCTCCAC TGTTCGC）和 PT21-E3-R（5′-AGTTATCTGCGTGA CCATCTCTG）用于擴增外顯子3。PCR體系為：Takara Ex Taq premix （RR902A）10 μL，DNA 模板0.5μL，上下游引物各 0.5 μL，ddH2O補齊至 20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃，30 s，60 ℃，30 s，72℃，60 s，共 35 個循環(huán)；最后 72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并克隆測序。使用MEGA 7.0對不同谷子和狗尾草的PT2基因序列進行同源性和單核苷酸多態(tài)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子PT2候選基因的篩選與分析

將數(shù)據(jù)庫中谷子、狗尾草以及其他植物的PT2候選基因編碼的蛋白質(zhì)進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)報道的水稻Os GRF4蛋白（Os02g47280基因編碼）[10-12]與谷子 Seita.1G287100、狗尾草Sevir.1G292200編碼的蛋白質(zhì)序列同源性較高（圖1-A）。其中，谷子Seita.1G287100和狗尾草Sevir.1G292200編碼的蛋白序列完全一致。該結(jié)果說明這2個基因分別是谷子和狗尾草的PT2基因。進一步分析3種植物的PT2蛋白質(zhì)序列發(fā)現(xiàn)，QLQ結(jié)構(gòu)域序列完全一致，而WRC結(jié)構(gòu)域也僅存在一個氨基酸差異（圖1-B）。該結(jié)果說明該生長調(diào)節(jié)因子中參與核酸或蛋白互作的2個重要位點高度保守，保障其正常執(zhí)行功能。

2.2 谷子PT2基因啟動子元件分析

將豫谷1號的PT2基因（Seita.1G287100）上游1 500 bp的序列進行在線分析，結(jié)果表明，該基因啟動子較為復(fù)雜。除了常見的TATA-box，CAAT-box等核心啟動子元件外，還有較多的響應(yīng)元件，比如，光 應(yīng) 答 響 應(yīng) 元 件 ACE，AE-box，BOXI，G-BOX，G-box，GT1-motif，I-box，L-box，sp1，TCT-motif；脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游響應(yīng)元件ABRE和motif-Iib；茉莉酸甲酯 （MeJA） 響應(yīng)元件 CGTCA-motif和TGACG-motif；赤霉素響應(yīng)元件 GARE-motif；缺氧特異性誘導(dǎo)響應(yīng)元件GC-motif；參與防御和應(yīng)激反應(yīng)響應(yīng)元件TC-rich-repeats等（表2）。另外，還有多種其他調(diào)控位點，比如調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平的5′UTR Py-rich stretch，MYBHv1 結(jié)合位點 CCAAT-box，胚乳表達所需skn-1 motif元件，玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控響應(yīng)元件O2-site，參與分生組織表達響應(yīng)元件CAT-box等。該預(yù)測結(jié)果說明PT2基因參與多種環(huán)境響應(yīng)及代謝調(diào)節(jié)，是重要的調(diào)節(jié)因子。另外，對谷子和狗尾草PT2基因的啟動子序列進行對比發(fā)現(xiàn)，二者只有8個核苷酸位點有差異（圖2）。其中，只有2個位點分別位于2個G-box元件中。該結(jié)果暗示在2種植物中，PT2基因的調(diào)控基本一致。

表2 PT2啟動子元件分析

2.3 谷子PT2家族基因表達部位分析

提取豫谷1號苗和穗的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用引物579F和1179R，檢測該基因在不同部位的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果表明，該基因在豫谷1號苗、穗部位均有表達（圖3）。說明PT2基因可能參與多種代謝調(diào)節(jié)和環(huán)境響應(yīng)。

2.4 PT2基因保守性分析

為分析PT2基因在不同品系中的保守性，將43種谷子和3種狗尾草的PT2基因前3個外顯子（包括OsmiR396結(jié)合位點、WRC和QLQ的編碼區(qū)域）進行了序列測定。

序列比對發(fā)現(xiàn)，其核酸序列高度保守，共發(fā)現(xiàn)4處SNP（圖4），但是只有一處導(dǎo)致氨基酸突變（T190A）。該突變位點（T190A）在谷子和狗尾草中均被檢測到，說明其與谷子和狗尾草之間籽粒性狀、落粒性的差異無關(guān)。

3 討論

對于水稻、小麥、谷子等禾本科作物而言，其籽粒大小、形狀、數(shù)量以及落粒等性狀是決定其產(chǎn)量高低的重要因素。研究表明，水稻PT2基因編碼的Os GRF4蛋白能夠調(diào)控籽粒形狀、大小以及落粒性等多種性狀。為研究該基因在谷子籽粒性狀調(diào)控中的作用，本試驗通過生物信息學(xué)的方法，確定了谷子和狗尾草中的PT2候選基因。通過對谷子PT2基因啟動子中各種相應(yīng)元件的分析發(fā)現(xiàn)，該基因的啟動子含有多種環(huán)境（如光照、干旱）和激素（如水楊酸、茉莉酸）等響應(yīng)元件，暗示其參與多種代謝調(diào)節(jié)。RNA轉(zhuǎn)錄檢測結(jié)果也顯示，其在植株不同部位均有表達，進一步確定該基因具有多重功能。但是，本研究并未發(fā)現(xiàn)該基因其他形式的轉(zhuǎn)錄本。

值得注意的是，谷子與狗尾草的PT2基因編碼蛋白序列完全一致，僅在個別品系中發(fā)現(xiàn)一個氨基酸的點突變。該點突變在谷子和狗尾草中均存在。該基因啟動子序列也基本吻合，僅存在幾個核苷酸的差異。其中，2個差異分別位于2個G-box元件中。這2個差異是否影響該基因?qū)δ承┮蛩氐捻憫?yīng)，尚未確定。然而，谷子和狗尾草籽粒性狀差異顯著，比如籽粒形狀明顯不同，落粒性完全相反。說明在2種植物體內(nèi)，其他未知的基因調(diào)控了上述差異，其與水稻不同。

本研究通過生物信息學(xué)的方法確定了谷子和狗尾草的PT2基因，并且通過二者間的比對，初步判斷PT2基因與谷子籽粒大小、形狀以及落粒性等性狀無關(guān)，結(jié)果為后續(xù)篩選相關(guān)基因奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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