小麥HMW-GS分子檢測中DNA提取方法的改良

張婷婷 ，王陸軍 ，郝建平 ，，王艷梅 ，王創云 ，李培良 ，鄧艷芳 ，周 瓊 ，李志敏 ，龐 冰 ，董永軍，裴成成，牛學謙

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院作物科學研究所，山西 太原 030031；3.山西省玉米工程技術研究中心，山西 太原 030031）

隨著人們對高品質小麥需求的增長，品質育種受到了更多科學家的關注。有研究表明，高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）組成是影響小麥品質的重要因素[1-2]。當前檢測HMW-GS的方法主要包括SDS-PAGE凝膠電泳和等位基因特異性擴增（AS-PCR）[3-4]，其中，AS-PCR 方法操作簡便，結果準確，可以實時檢測，是實現小麥HMW-GS分子育種的有效檢測方法。而高質量、高通量的DNA提取是實現HMW-GS實時檢測的前提。前人提取基因組DNA的方法主要包括傳統CTAB法[5-8]、SDS法[9-10]、堿裂解法[11-12]、酶解法、磁珠法[13]、硅膠柱法[14]等，這些方法多以幼葉為提取材料，存在成本高、周期長、操作復雜或質量不穩定等問題。

本研究在傳統CTAB法的基礎上，針對小麥種子蛋白、淀粉含量高的特點，結合磁珠法，旨在尋求一種操作簡便、成本低廉、產率和質量穩定的DNA提取方法，以滿足日益增加的HMW-GS高通量分子檢測的需求。

1 材料和方法

1.1 材料

供試10份小麥材料（Triticum aestivum L.）均由山西省農業科學院作物科學研究所提供，其品種名稱與亞基組成如表1所示。

1.2 試劑

2%CTAB裂解液，氯仿∶異戊醇（24∶1），70%乙醇，異丙醇，TE（含RNaseA），磁珠懸浮液。

表1 10份小麥材料及其亞基組成

1.3 儀器

HH數顯恒溫水浴鍋（常州市第一紡織設備有限公司）；Tissuelyser-96全自動樣品快速研磨儀（上海拓赫機電科技有限公司）；5810R低溫高速離心機（德國Eppendorf艾本德股份公司）；PCR儀（德國Eppendorf艾本德股份公司）；K5600超微量紫外可見分光光度計（北京凱奧科技發展有限公司）；JY-SPCT君意東方水平型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；Tanon 2500凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 傳統CTAB法 參照魏琦超等[15]的方法。

1.4.2 小麥DNA提取新方法 取1粒小麥種子，加入700 μL CTAB提取液（65℃）；粉碎成勻漿狀；將樣品放入65℃水浴鍋中，水浴30 min；加入等體積氯仿/異戊醇混合液（體積比24∶1），充分混勻3 min；4 ℃，14 000 r/min 離心 10 min，取上清；重復抽提一次；加入5 μL的磁珠懸浮提取液，混勻，靜置5 min，棄上清；用70%乙醇洗滌磁珠1～2次，風干磁珠；加 50 μLTE（含 RNaseA），65 ℃水浴 5 min，-20℃保存。

1.4.3 DNA質量檢測

1.4.3.1 紫外分光光度法檢測 采用紫外分光光度計測定DNA原液的濃度及其A260/230，A260/280的值。

1.4.3.2 瓊脂糖凝膠電泳 取4 μL的DNA原液與2 μL的6×Loadingbuffer混合均勻，用0.8%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓100 V，電泳60 min。

1.4.4 HMW-GS分子檢測 引物1AX2*[16]序列F：5′-ATGACTAAGCGGTTGGTTCTT-3′；R：5′-ACCTT GCTCCCCTTGTCTTT-3′。以新方法提取的DNA為模板，對亞基2*進行AS-PCR，擴增程序參照孫巖等[17]的方法，并進行了改進，采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2 結果與分析

2.1 DNA產率比較

紫外分光光度計檢測結果顯示，新方法提取的DNA比對照（傳統CTAB法）平均產率降低，標準差減小（表2）。瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，對照的電泳條帶亮度比較高，差異較大（圖1），新方法提取的DNA電泳條帶相對亮度較低，但差異較小（圖2）。2種檢測結果均證實了新方法提取的DNA產率降低，但穩定性更好。

表2 分光光度計檢測結果

2.2 DNA質量比較

從表2可以看出，對照和新方法提取的DNA的A260/280平均值均在1.8～2.0，但新方法標準差較小。從圖1，2可以看出，對照的DNA膠孔較亮，有拖尾現象，且條帶不整齊，而新方法提取的DNA電泳條帶清晰一致，背景噪點較少。因此，采用新方法提取的DNA質量更高更穩定。

2.3 HMW-GS分子檢測

選擇10份小麥種質資源，采用新方法提取的基因組DNA為模板，對亞基2*進行等位基因特異性擴增（AS-PCR）。電泳檢測結果（圖3）顯示，條帶清晰，片段大小為1 319 bp，這與SDS-PAGE檢測結果一致。因此，新方法提取的DNA可以用于小麥高分子量谷蛋白亞基（HMW-GS）的分子檢測。

3 討論與結論

本研究對DNA提取過程進行了改進：樣品在CTAB裂解液的保護下直接機械粉碎破壞細胞壁，省去了液氮研磨；在沉淀DNA時，放棄加入異丙醇沉淀20 min，而采用磁珠定向吸附DNA，直接以70%的酒精洗滌。通過上述改進，提高了DNA的質量和穩定性，簡化了操作，縮短了提取周期，使高通量提取成為可能。

本研究在測量DNA的A260/280值時發現2種方法的平均值均在理想范圍內，雖然存在差異但不顯著，在瓊脂糖凝膠電泳檢測中二者結果差異顯著，尤其傳統CTAB法提取的DNA一致性差，而新方法提取的DNA純度高、穩定性好。說明紫外分光光度計所測得數值相對誤差較大，這一結果與前人研究結果一致[18]。因此，在檢測DNA質量時，建議先采用紫外分光光度計進行檢測，然后以瓊脂糖凝膠電泳驗證結果。

HMW-GS分子檢測相對SSR[19]等分子標記，對DNA質量要求更高，本研究檢測了HMW-GS中的2*亞基，結果清晰準確，證明新方法可以用于小麥HMW-GS 分子檢測[20]。

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