益氣補(bǔ)腎法對裸鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移抑制作用及機(jī)制研究*

姚勇偉 朱飛葉 劉云霞 王翌慶 徐葉峰 浙江省杭州市第三人民醫(yī)院 浙江 杭州 30009 浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 30053

乳腺癌占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位[1]，而肺部是乳腺癌較為常見的轉(zhuǎn)移部位[2]。臨床中乳腺癌術(shù)后發(fā)生的肺轉(zhuǎn)移，患者存活率往往較低。我們前期研究表明，益氣補(bǔ)腎法在預(yù)防和治療乳腺癌術(shù)后的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移方面，有不錯(cuò)的治療效果[3]，有必要對其作用機(jī)制作進(jìn)一步的研究和探討。本實(shí)驗(yàn)采用左心室注射法制造乳腺癌術(shù)后肺轉(zhuǎn)移裸鼠模型，觀察益氣補(bǔ)腎法對轉(zhuǎn)移瘤的抑制作用，并探討其可能作用機(jī)制。現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c裸鼠（SPF級），均為雌性，體重18～20g，共40只，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供飼養(yǎng)并實(shí)施實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞株：人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231，從中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所購買。

1.3 試劑與藥品：DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），胎小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司），基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP-1、MMP-9）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）ELISA試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。大補(bǔ)元煎（《明·景岳全書》）：杭州市第三人民醫(yī)院中藥房提供（炒黨參、熟地、杜仲、當(dāng)歸、山茱萸、枸杞、炙甘草，劑量比例為3:3:3:2:3:1:3:2）。按比例取藥物適量，加5倍量水浸泡1h，煎煮60min，再加3倍量水，煎煮30min，合并兩次煎液，濾過，濃縮至

1.5g/ml，備用。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：人乳腺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株MDA-MB-231置于含10%胎小牛血清的DMEM培養(yǎng)液（含100IU/ml青霉素，100ug/ml鏈霉素）中，并在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化，換液及傳代。

2.2 模型制備：SPF級BALB/c裸鼠40只，常規(guī)飼養(yǎng)5天后采用左心室注射法[4]進(jìn)行造模。取對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按照文獻(xiàn)方法[5]，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，裸鼠麻醉后左心室推注腫瘤細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種量為1×107個(gè)細(xì)胞。注射后共有4只裸鼠死亡。

2.3 分組治療：將36只裸鼠隨機(jī)分為治療組和模型組，每組18只，自造模后第2天起，參照《中藥藥理研究方法學(xué)》[6]計(jì)算人鼠等效劑量。治療組每天予以大補(bǔ)元煎煎劑灌胃（濃度為1.5g/ml，相當(dāng)于生藥15g/kg/日），模型組予以等量的生理鹽水灌胃。給藥方法為0.4ml/d灌胃，每周連續(xù)給藥5天，停藥2天，共40天。

2.4 檢測指標(biāo)：摘眼球取血，離心制備血清備用；開胸取出肺組織，經(jīng)過處理后在解剖顯微鏡下數(shù)出肺表面白色轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)總數(shù)并計(jì)算抑制率。采用ELISA法檢測裸鼠血清中MMP-1、MMP-9和VEGF含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；兩樣本間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 裸鼠一般情況：模型組裸鼠精神萎靡，皮膚粗糙，飲食及活動(dòng)量減少，2只出現(xiàn)癱瘓癥狀；治療組裸鼠精神、飲食和活動(dòng)度較模型組好，未見癱瘓。在治療過程中，每組各有3只裸鼠死亡。治療組平均體重19.84±1.02g,模型組17.46±0.86g,2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3.2 裸鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移情況：瘤重抑制率=（模型組平均瘤重-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重×100%。肺轉(zhuǎn)移瘤抑制率=（模型組平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)-治療組平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)/模型組平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)×100%。與模型組比較，治療組的平均瘤體重量、平均肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量和體積均較小。見表1、圖1。

表1 兩組裸鼠肺轉(zhuǎn)移情況比較

圖1 裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤圖片

3.3 病理觀察結(jié)果：轉(zhuǎn)移瘤組織內(nèi)可見大量異型性細(xì)胞，核大深染，有病理性核分裂現(xiàn)象。見圖2。

圖2 裸鼠正常肺和轉(zhuǎn)移灶病理對比

3.4 兩組MMP-1、MMP-9和VEGF含量：見表2。

表2 2組裸鼠血清MMP-1、MMP-9和VEGF含量比較（±s，ng/ml）

表2 2組裸鼠血清MMP-1、MMP-9和VEGF含量比較（±s，ng/ml）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

模型組治療組5.96±0.83 5.35±0.81*17.18±3.44 13.54±3.56**15.61±1.97 13.12±1.55**

4 討論

乳腺癌最容易的轉(zhuǎn)移的靶器官是肺、骨、肝臟，在預(yù)后方面，內(nèi)臟轉(zhuǎn)移（肺和肝）預(yù)后最差。因此，研究乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的有效藥物顯得尤為重要。腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移的演變過程中，腫瘤組織通過多種途徑來降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（ECM），并越過基質(zhì)屏障導(dǎo)致腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在ECM的降解過程中起著重要的作用，其中MMP-1、MMP-9分布最廣。研究發(fā)現(xiàn)MMP-1和MMP-9在乳腺癌患者中的水平要明顯高于良性乳房疾病患者，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、惡性程度高、腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)。VEGF可以為腫瘤細(xì)胞的生長和新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供營養(yǎng)[7]。因此上述蛋白和因子在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

從中醫(yī)學(xué)角度分析，乳腺癌術(shù)后患者多以氣血虧虛，沖任失調(diào)，余毒未清為主要病機(jī)?！罢龤獯鎯?nèi)，邪不可干”，我們可以通過補(bǔ)益正氣，從而減少可能出現(xiàn)的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)[8]。本研究采用的大補(bǔ)元煎方中黨參大補(bǔ)元?dú)?，熟地、?dāng)歸滋陰補(bǔ)血，枸杞、萸肉補(bǔ)益肝腎，杜仲溫補(bǔ)腎陽，甘草助補(bǔ)益而調(diào)和諸藥。全方補(bǔ)氣血、調(diào)陰陽，扶養(yǎng)正氣，拒邪內(nèi)干，從而起到預(yù)防轉(zhuǎn)移的作用。

通過本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)中藥治療組能明顯縮小裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤，減少轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)，且血清中MMP-1、MMP-9、VEGF的含量明顯低于模型組。初步證實(shí)，益氣補(bǔ)腎中藥能可能通過抑制MMP-1、MMP-9、VEGF的表達(dá)，抑制新生腫瘤的血管生成，從而達(dá)到抑制乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。

5 參考文獻(xiàn)

[1]張思維，雷正龍，李光琳，等.中國腫瘤登記地區(qū)2006年腫瘤發(fā)病和死亡資料分析[J].中國腫瘤，2010，19（6）：356-365．

[2]Hery M,Delozier T,Ramaioli A,et al.Natural history of node-negative breast cancer：are conventional prognostic factors predictor of time to relapse？[J].Breast,2002,11(5)：442-448．

[3]姚勇偉，朱飛葉，劉云霞，等.益氣補(bǔ)腎法對裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2016，34(11)：1673-1677.

[4]李瓊.骨高轉(zhuǎn)移人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231BM3及其動(dòng)物模型的建立[J].腫瘤，2009,29(11)：1031-1035．

[5]Price JE,Polyzos A,Zhang RD,et al.Tumorigenicity and metastasis of human breast carcinoma cell lines in nude mice[J].Cancer Res,1990,50(3)：717-721.

[6]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1996：33.

[7]Hanahan D,Folkman J.Patterns and emergine mechanisms of the angiogenics witch during tumor genesis[J].Cell,1996,86(3)：353-356.

[8]蔣沈君,劉云霞,楊潔文.自擬疏肝補(bǔ)腎方治療乳腺癌相關(guān)骨質(zhì)疏松癥21例觀察[J].浙江中醫(yī)雜志,2015,50(7)：518.