腦缺血再灌注損傷后自噬機制及自噬相關信號通路的研究進展

李燕則 郭永清 衛建峰 鄭李娜

[摘要]自噬是真核生物進化上高度保守的一種物質分解代謝途徑，主要用于分解和回收利用細胞內受損的細胞器、錯誤折疊的長效大分子。但自噬的過度激活，對于機體來說卻是一種損傷機制。腦缺血再灌注損傷的損傷機制除與機體多種病理生理過程有關外，自噬也發揮了相當重要的作用。自噬逐漸變成預防和治療人類多種重大疾病的靶點，其機制研究也變成研究焦點。本文旨在概括自噬的相關概念，研究自噬與腦缺血再灌注損傷的關系，介紹自噬發生的相關信號通路。

[關鍵詞]腦缺血再灌注損傷；自噬；信號通路；mTOR

[中圖分類號] R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（c）-0029-04

Progress autophagy mechanism and autophagy-related signaling pathways after cerebral ischemia-reperfusion injury

LI Yan-ze1 GUO Yong-qing2▲ WEI Jian-feng2 ZHENG Li-na2

1.Department of Anesthesiology，Shanxi Medical University，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China；2.Department of Anesthesiology，Shanxi Provincial People′s Hospital，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China

[Abstract]Autophagy is a highly conserved material decomposition and metabolism pathway in the evolution of eukaryotes，which allows the orderly degradation and recycling of intracellular damaged organelles or misfolded long-acting macromolecule.But hyperactivation of autophagy is an injury mechanism for the body.The injury mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury is not only related to various pathophysiological processes，but also plays an important role in autophagy.Since autophagy has gradually become a target for the prevention and treatment of a variety of major diseases in human beings，its mechanisms arose increasing attention.This paper aims to summarize the related concepts about autophagy，study the relationship between autophagy and cerebral ischemia reperfusion injury as well as introduce the signaling pathways involved in autophagy.

[Key words]Cerebral ischemia reperfusion injury；Autophagy；Signal path；mTOR

世界衛生組織的數據表明，腦血管疾病是造成人類死亡的主要原因之一，因此，找到該種類型疾病正確的治療途徑有助于腦血管疾病工作的順利展開[1]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury）是指腦組織因缺血導致其結構和功能的損害，但是有時缺血后再灌注不僅不能使結構和功能恢復，反而加重其損害，其損害嚴重程度與缺血時間、需氧程度及殘余血流量有關，損傷區根據血流殘存的多少分為中心區和半暗帶區，中心區細胞死亡主要是細胞壞死，而半暗帶區主要是細胞凋亡和自噬。半暗帶區細胞仍有代謝活力，故對該區進行抗缺血治療是阻止細胞惡化，減輕腦缺血再灌注損傷的重要手段。

1自噬的相關概念

人體內環境的穩態主要靠物質合成與分解代謝的正常進行來維持。自噬是真核生物細胞一條重要的物質分解代謝途徑，泛素蛋白酶體途徑是另一條重要途徑，二者的功能和結構各有特點[2]。細胞內受損的細胞器、錯誤折疊的高效大分子主要是通過自噬途徑分解，進而實現細胞內環境的高效穩定運轉。依據底物與溶酶體結合方式的不同將自噬分為三類：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy）。它們各有分工，在真核細胞中，巨自噬最容易發生，與腦缺血再灌注損傷的關系也最為密切。巨自噬的發生主要序貫性經歷下面4個步驟：①誘導自噬發生；②形成自噬體；③自噬體與溶酶體膜的融合；④降解自噬體。微自噬指溶酶體膜內陷包裹目標靶物并被水解酶分解的過程[3]，而分子伴侶介導的自噬則指底物特定氨基酸序列（如KFERQ）在胞漿中的分子伴侶熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSC70）的介導下識別溶酶體膜上特異的受體溶酶體相關的膜蛋白2a（lysosome-associated membrane protein 2a，Lamp2a），使得底物與溶酶體結合，并由水解酶降解的過程[4]。

2自噬與腦缺血再灌注損傷

機體正常的自噬比較保守，其發生維持在適當水平，主要用于清除胞內受損的細胞器、錯誤折疊的長效大分子等，以維持細胞高效穩定的代謝需求[5]。然而，超過限度自噬并不能維持細胞穩定，一定程度上會加劇損傷，促進細胞死亡。該種細胞死亡是一種細胞程序性死亡，被稱為自噬性細胞死亡或Ⅱ型程序性細胞死亡[6-8]。

Wang等[9]研究發現，大鼠全腦缺血再灌注后30 min，透射電鏡下可見海馬自噬體及自噬相關蛋白LC3-Ⅱ形成，24～48 h仍舊維持在較高水平。腦缺血前30、60 min，在腦立體定位儀輔助下向側腦室內靶向注射自噬抑制劑3-MA，發現海馬神經細胞死亡抑制組織蛋白（cathepsin）B釋放減少和原位末端標記（TUNEL）陽性細胞數量降低。可見，自噬參與腦缺血再灌注損傷，抑制自噬亦可顯著減輕神經細胞缺血再灌注損傷。

3腦缺血再灌注損傷后自噬發生的相關信號通路

準確高效的信號通路調節，使得細胞能夠應對各種外界刺激并維持自身穩定。TOR（target of rapamycin）是一種調控細胞周期、生長和增殖的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞自噬信號通路的一種調控蛋白，外界不良刺激引起的細胞因子的變化可被TOR感知，影響自噬的發生。發生細胞內氧糖剝奪等，都可激活或抑制TOR活性，從而影響細胞自噬的發生[10]。

而在哺乳動物中，主要存在正常處于活化狀態TOR的同源物哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）。mTOR可抑制自噬起始分子ULK1的活性，降低自噬的發生水平。TOR/mTOR能形成 TORC1/mTORC1和TORC2/mTORC2兩種復合物。mTORC1包括PRAS40（proline-rich akt substrate 40 kDa）、也稱為類G蛋白β亞基蛋白GβL（mLST8）、mTOR和Raptor（regulatory-associated protein of mTOR）。而雷帕霉素作用的主要靶點是Raptor[11]，雷帕霉素與其結合后，可抑制mTORC1的活性而誘導自噬的發生。mTORC2包括mTOR、mSin1（mammalian stress-activated protein kinase-interacting protein 1）、Protor（protein observed with rictor）和Rictor（rapamycin insensitive companion of mTOR），而Rictor對雷帕霉素不敏感。蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）可以被mTORC2磷酸化，影響細胞骨架的形成[12]，但關于mTORC2和自噬的關系卻鮮有報道。

3.1 PI3K/AKT/mTOR信號通路

研究發現，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt/mTOR信號通路對自噬起著重要的調控作用，mTOR作為該通路中調控自噬的關鍵因子，它的活性是自噬體形成、成熟的關鍵[13-16]。

PI3K是一種具有蛋白激酶及磷脂激酶的雙重活性的蛋白，主要存在于細胞質中。外界刺激引起細胞一系列變化信號，激活跨膜的酪氨酸激酶，從而招募PI3K的p85亞基，繼而P110亞基接收信號改變，激活PI3K[17]。PI3K可通過一系列信號傳遞激活Akt，通過下列途徑激活mTOR：一是直接激活mTOR；二是通過抑制TSC1 /TSC2復合物的形成，間接激活mTOR。

結節性硬化復合物（tuberous sclerosis complex，TSC）是mTOR上游可調節mTOR活性一種化學分子。TSC2被稱為GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP），可以通過激活GTP酶，使腦內Ras同系物（ras homolog enriched in brain，Rheb）Rheb-GTP由活化型變成失活的Rheb-GDP[18]。活化型的Rheb-GTP能夠通過Raptor，激活mTORC1。Akt激活后，磷酸化TSC2，阻止TSC1/2復合物形成，進而阻止Rheb-GTP失活，激活mTORC1，抑制自噬。Raf-1-MEK1/2-ERK1/2也可抑制TSC1/TSC2，最終激活Rheb-mTORC1，抑制細胞自噬的發生[19]。

這一信號通路調控受第十號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted from chromosome 10，PTEN）的負性調控，PTEN可以通過抑制PI3K的活性，誘導自噬的發生[17]。

細胞在穩定狀態時，有活性的mTOR可以引起自噬蛋白Atg13高度磷酸化，從而降低Atg13和Atg的活性[20]，使其招募下游PI3K、LC3的能力下降，自噬體形成水平降低，故而降低自噬發生水平，從而達到精確調節細胞代謝的目的。

3.2 AMPK-TSC1/2-mTOR信號通路

研究發現，p38 通路能夠誘導自噬的發生[21]。在缺血性腦疾病中，抑制p38可以抑制自噬，從而達到保護腦損傷的目的。

AMPK的另外一條通路ERK1/2也對自噬起正性調控作用。db/db小鼠中，ERK1/2活性下降或增強導致自噬和自噬相關蛋白Atg-7表達的減少或增加，進而抑制或促進自噬[22]。

AMPK可感知能量的變化，當正常機體突然遭到應激時，如缺血缺氧，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平下降，即會激活AMPK，活化的AMPK可以抑制TSC2磷酸化，使Rheb-GTP失活，從而降低mTORC1的活性，激活自噬[23]。此外AMPK可通過DNA損傷反應調節基因1（regulated indevelopment and DNA damage response 1，REDD1），增強或抑制TSC1/2的活性。在機體缺血缺氧時，AMPK可以誘導REDD1的表達，使得TSC2脫離其抑制性結合蛋白14-3-3，使得活化型Rheb-GTP變成失活Rheb-GDP，進而促進mTORC1失活[24]，促進自噬發生。

3.3 P53途徑

p53亦參與調控細胞自噬。正常機體的p53含量較低，在細胞核中，通常與鼠雙小蛋白2（murine double minute 2，MDM2）結合成異二聚體，調控細胞的增殖分化。當細胞受到外界各種突然刺激時，如缺血缺氧、氧化應激、化學藥物等，都能引起細胞內的蛋白激酶和NK（c-Jun amino-terminal kinase）磷酸化而激活p53。研究表明，p53在細胞核和細胞質中以不同調節方式調節細胞自噬。在細胞核中，p53主要通過轉錄依賴性方式促進細胞自噬的發生。而在細胞質中的p53能以轉錄非依賴方式抑制自噬發生，主要是通過抑制AMPK活性和激活mTOR來實現的[25-26]。

在細胞中，p53亦可通過直接或間接激活mTOR上游一些調節因子而影響細胞自噬，這些因子主要包括PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome10）、AMPK、TSC2等。p53也可以直接反式激活TSC2，抑制mTOR的活性，上調細胞自噬。

p53在一定條件下可以激活蛋白激酶1（death-associated protein kinase1，DAPK1）以及促凋亡蛋白Bcl-2家族成員Bax、Bad、Bnip3和Puma等，這些因子可使自噬蛋白Beclin1與Bcl-2/Bcl-xL相互分離，而上調細胞自噬[27]。可見，p53可通過下調mTOR的活性或其他調節方式促進細胞自噬發生。

4小結

綜上所述，隨著分子生物學中越來越多信號通路機制的不斷揭示，近些年來研究腦缺血再灌注損傷后自噬的相關信號通路作用機制的文獻也逐漸增多，但尚有未發現的信號通路。究竟通過何種措施在特定時機作用于相關信號通路，進而通過減輕自噬而減輕腦缺血再灌注損傷程度，還需要大量實驗與實踐來進一步探索。本文所述mTOR作為調控自噬通路的關鍵蛋白，闡明其所在信號途徑及其作用，將對神經系統缺血再灌注腦損傷疾病提供至關重要的的治療方案。

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（收稿日期：2018-01-08 本文編輯：孟慶卿）