腎纖康顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳玉蘭 沈宏萍 趙 劍 蒲清榮*

（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

腎纖康是我院腎病科的臨床經(jīng)驗方，已臨床應(yīng)用6年，擬將該經(jīng)驗方開發(fā)為醫(yī)院制劑[1]。該方由黃芪、淫羊藿、西洋參、當(dāng)歸、水蛭等藥組成，可補(bǔ)益脾腎、通絡(luò)消癥。用于各種慢性腎臟疾病，臨床療效顯著。為加強(qiáng)醫(yī)院制劑質(zhì)量控制，保障臨床藥物安全、有效，故采用薄層色譜鑒別法對制劑中的黃芪、大黃、當(dāng)歸3味中藥材進(jìn)行定性鑒別，以淫羊藿苷為指標(biāo)性成分采用高效液相色譜進(jìn)行含量測定，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent Technologies1200高效液相色譜儀；Kromasil 100-5-C18鍵合硅膠柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；AP-01P真空泵；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋。

試藥：黃芪甲苷對照品（批號110781-201314）；大黃酸對照品（批號：0757-200206）；阿魏酸對照品（批號：0773-9910）；淫羊藿苷（110737-200415）；腎纖康顆粒（西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號170601、170602、170603）

試劑：薄層層析用硅膠G、硅膠H（青島海洋化工有限公司）；乙腈為色譜純；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

2 薄層色譜鑒別

2.1 黃芪薄層色譜鑒別：取批號170601樣品10 g，研細(xì)，加50 mL甲醇回流提取1 h，放冷，過濾，濾液蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，用水飽和的正丁醇60 mL分2次萃取，合并正丁醇液；用1%的NaOH溶液40 mL分2次洗滌，取正丁醇層揮干，加0.5 mL甲醇使殘渣溶解，作為供試品溶液。制備每1 mL甲醇含1 mg的黃芪甲苷對照品溶液[1]。分別吸取對照品溶液2 μL、供試品溶液5 μL，點于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-水-甲醇（13∶2∶7）下層溶液為展開劑，展開，展距為10 cm，取出晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘烤至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的棕褐色斑點[2-4]。見圖1。

2.2 大黃的薄層色譜鑒別：取批號170601樣品10 g，研細(xì)，加50 mL甲醇超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加15 mL水使溶解，再加鹽酸1 mL，回流提取30 min，放冷后，用乙醚40 mL分2次振搖提取，合并乙醚液，揮干，加2 mL三氯甲烷使殘渣溶解，作供試品溶液。制備每1 mL甲醇含2 mg的大黃酸對照品溶液[1]。分別吸取對照品溶液4 μL，供試品溶液10 μL，點于硅膠H薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（7.5∶2.5∶0.6）的上層溶液為展開劑，展開，展距8 cm，取出晾干，置紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橙黃色熒光斑點[5-6]。見圖2。

2.3 當(dāng)歸薄層色譜鑒別：取批號170601樣品10 g，研細(xì)，加50 mL甲醇超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣用20 mL水溶解，用乙酸乙酯40 mL分2次萃取，取乙酸乙酯液，蒸干，加甲醇1 mL使殘渣溶解，作為供試品溶液。制備每1 mL甲醇含0.5 mg的阿魏酸對照品的溶液[1]。分別吸取對照品溶液5 μL，供試品溶液10 μL，點于硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲酸-乙酸乙酯（5∶0.2∶2）為展開劑，展開，展距10 cm，取出晾干，噴10% H2SO4-EtOH，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點[7-8]。見圖3。

3 含量測定方法與結(jié)果

3.1 色譜條件：流動相：乙腈-水（30∶70）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/L。

3.2 線性范圍的考察

3.2.1 貯備液的制備：精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇溶解，搖勻，制得濃度0.216 mg/mL的溶液作對照品貯備液。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

圖1 腎纖康顆粒中黃芪的TLC

圖2 腎纖康顆粒中大黃的TLC

圖3 腎纖康顆粒中當(dāng)歸的TLC

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線：從對照品貯備液中分別精密吸取1、2、3、4、5、7 mL于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別吸取10 μL注入液相色譜儀。以淫羊藿苷溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），其峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：Y=13.712X -32.021，n=6。結(jié)果淫羊藿苷在21.6～151.2 μg/mL范圍內(nèi)峰面積與質(zhì)量呈良好的線性關(guān)系，其淫羊藿苷對照品色譜圖見圖4[9]。

圖4 淫羊藿苷對照品色譜圖

3.3 供試品溶液制備：精密稱定批號170601樣品5 g，加入稀乙醇40 mL，稱重，超聲1 h，再次稱重，用稀乙醇補(bǔ)足減少的重量，過濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜濾過，即得[10]。

3.4 精密度試驗：取濃度0.0432 mg/mL的淫羊藿苷對照品溶液，精密吸取10 μL連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄其峰面值積，結(jié)果RSD=0.33%，試驗表明該儀器精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗：吸取濃度0.0432 mg/mL的淫羊藿苷對照品溶液，精密吸取10 μL，分別于0、2、4、8、12、18 h進(jìn)樣，記錄淫羊藿苷峰面積，峰面積的RSD為0.54%，結(jié)果表明制備的供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性試驗：取批號170601樣品6份，按3.3項下的方法制備供試品溶液，在上述液相色譜條件下測定溶液中淫羊藿苷的含量，結(jié)果該批樣品的淫羊藿苷含量平均值0.2992 mg/g，RSD為0.57%。該試驗方法重復(fù)性較好。供試品色譜圖見圖5。

3.7 回收率試驗：精密稱取批號170601樣品2.5g，6份，分別精密加入淫羊藿苷對照品溶液（精密稱取9.21 mg淫羊藿苷對照品置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濃度0.3684 mg/mL）2 mL，其余按3.3項下方法繼續(xù)制備供試品溶液，在3.1項色譜條件下，進(jìn)樣測定淫羊藿苷面積，計算淫羊藿苷的加樣回收率，見表1，表明該方法回收率良好，符合含量測定要求。

圖5 供試品色譜圖

3.8 樣品測定：取批號170601、170602、170603腎纖康顆粒，分別測定，三批樣品含量分別為0.292 mg/g、0.303 mg/g、0.295 mg/g。

4 討 論

4.1 采用薄層色譜法，對黃芪、大黃、當(dāng)歸進(jìn)行TLC鑒別，色譜斑點清晰，分離效果良好，具有方法簡單、快速、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。

4.2 在淫羊藿苷的含量測定中，其在206 nm和270 nm波長處均有吸收峰，但206 nm處雜質(zhì)吸收峰較多，故選270 nm為檢測波長。在流動相的考察中，曾以乙腈-水（26∶74）為流動相，但分離效果不好，又選擇乙腈-水（30∶70）為流動相，分離度較好。

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