血紅素加氧酶1在間歇性低氧大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的影響

王媛媛 曹 建* 萬(wàn)建華

（1 南昌市第三醫(yī)院心內(nèi)科，江西 南昌 330009；2 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，江西 南昌 330009；3 景德鎮(zhèn)市中醫(yī)院麻醉科，江西 南昌 330009）

在心肌缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后組織損傷加重，甚至發(fā)生不可逆損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷（MIRI）。氧自由基和鈣超載是導(dǎo)致再灌注損傷的重要原因，但并不是唯一因素。其他因素還包括有血小板介導(dǎo)的損傷，腎素-血管緊張素系統(tǒng)和補(bǔ)體的激活等[1-3]。如何減輕MIRI，開(kāi)發(fā)研究心肌缺血再灌注的多靶點(diǎn)治療對(duì)于防治缺血性心臟病和臨床心臟病介入性治療的具有重大價(jià)值和意義。有研究發(fā)現(xiàn)，間歇性暴露于適當(dāng)?shù)脱醐h(huán)境可激發(fā)機(jī)體的適應(yīng)機(jī)制，進(jìn)而產(chǎn)生有利的影響[4]。間歇性低氧適應(yīng)具有明顯的心臟保護(hù)作用，可減輕應(yīng)激、缺血對(duì)心肌的損傷。但有關(guān)間歇性低氧心肌保護(hù)的具體機(jī)制研究甚少。本實(shí)驗(yàn)擬在研究HO-1在間歇性低氧狀態(tài)下對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑：本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(guò)，許可證號(hào)為SCXK（贛）2009-0001。取8～10周左右健康清潔級(jí)SD大鼠54只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，由南昌大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，所有動(dòng)物均分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飲食。全蛋白濃度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品（普利萊公司）；兔抗小鼠HO-1抗體購(gòu)自Santa Cruz生物科技公司；辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及模型建立：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體質(zhì)量隨機(jī)分為3組：分為假手術(shù)組、缺血再灌注組、間歇性低氧-缺血再灌注組。制作間歇性低氧模型[5]，將大鼠暴露在每日4次的低氧循環(huán)（每次接受2 min 6%～8%低氧，3 min氧和處理，循環(huán)5次），處理14 d，含氧量正常的假手術(shù)組作為對(duì)照組。假手術(shù)組（n=18），絲線穿過(guò)冠狀動(dòng)脈左室支但不結(jié)扎，經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水；缺血再灌注對(duì)照組（n=18），參照趙秀梅墊扎球囊法[6]制作大鼠缺血再灌注模型，間歇性低氧+缺血再灌注組（n=18），建立間歇性低氧動(dòng)物模型后，再制作缺血再灌注模型。

1.3 大鼠左心室舒張期末容積、左心室收縮期末容積、左心室射血分?jǐn)?shù)測(cè)定：所有大鼠在外科處理后8周后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。所有測(cè)量均由同一觀察者行雙盲法測(cè)量，所有測(cè)量結(jié)果均連續(xù)測(cè)3次取平均值。將超聲心動(dòng)圖基礎(chǔ)參考值由假手術(shù)組測(cè)得，小鼠用異氟烷（2%in oxygen）行全麻，采用12 MHz探頭進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查。二維心室圖可從四個(gè)腔室和胸骨旁長(zhǎng)軸和短軸定位獲得。左心室舒張期末容積（LVEDV）和收縮期末容積（LVESV）通過(guò)Modified Simpson Rule測(cè)量，左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）=（LVEDV-LVESV）/LVEDV×100%。

1.4 Western blot法檢測(cè)HO-1蛋白表達(dá)：制模結(jié)束，處死手術(shù)處理后的存活大鼠。采用Western blot方法測(cè)定HO-1蛋白，提取心肌組織，采用考馬斯亮藍(lán)法蛋白質(zhì)定量。蛋白變性后，將含有20 μg蛋白的樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉液封閉，用特異性CHOP抗體孵育，4 ℃過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯影液檢測(cè)底物表達(dá)，結(jié)果經(jīng)化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀拍照。用Scion Image 4.03軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白灰度值與β-actin蛋白灰度值的比值，作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：計(jì)量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用。采用SPSS 17.0軟件單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行組間差異的檢驗(yàn)，組間兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心室舒張期末容積、左心室收縮期末容積、左心室射血分?jǐn)?shù)：假手術(shù)組、缺血再灌注組、間歇性低氧+缺血再灌注組大鼠在外科處理后8周后通過(guò)超聲心動(dòng)圖測(cè)量LVEDV、LVESV、LVEF，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組大鼠左室收縮期末容積、舒張期末積體積增加，左室射血分?jǐn)?shù)下降。間歇性低氧處理后，左室收縮期末容積、舒張期末積體積增加，左室射血分?jǐn)?shù)增加，心功能改善。各實(shí)驗(yàn)組LVEDV、LVESV、LVEF與假手術(shù)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組左心室收縮期末期容積、舒張末期容積、射血分?jǐn)?shù)（±s，n＝18）

表1 各實(shí)驗(yàn)組左心室收縮期末期容積、舒張末期容積、射血分?jǐn)?shù)（±s，n＝18）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與I/R組比較，#P＜0.05

組別 LVEDV(μL) LVESV(μL) LVEF(%)假手術(shù)組 426±3.2 182±4.1 57±3.9 I/R組 782±1.6* 547±3.5%* 29±1.6*IH+I/R組 518±4.7# 392±2.8# 46±5.3#

2.3 各實(shí)驗(yàn)組心肌組織HO-1蛋白表達(dá)：通過(guò)Western blot法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組HO-1蛋白水平，與假手術(shù)組比較，缺血再灌注組HO-1蛋白蛋白表達(dá)降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；與缺血再灌注組比較，間歇性低氧處理后，間歇性低氧-缺血再灌注組HO-1蛋白表達(dá)明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），提示間歇性低氧促進(jìn)了Nfr2蛋白表達(dá)增加。見(jiàn)表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組HO-1蛋白表達(dá)（±s，n=16）

表2 各實(shí)驗(yàn)組HO-1蛋白表達(dá)（±s，n=16）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與缺血再灌注組比較，#P＜0.05

組別 只數(shù) HO-1假手術(shù)組 18 0.392±3.176缺血再灌注組 18 0.217±1.326*間歇性低氧-缺血再灌注組 18 0.982±4.538#

注：A（假手術(shù)組），B（缺血再灌注組），C（間歇性低氧+缺血再灌注組）

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展及溶栓、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)等各種治療缺血性心臟病方法的廣泛開(kāi)展，MIRI也越來(lái)越常見(jiàn)，表現(xiàn)為再灌注后缺血的心肌出現(xiàn)舒縮功能降低、再灌注心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結(jié)構(gòu)的變化及血管無(wú)復(fù)流等現(xiàn)象[7]。如何防治心肌缺血/再灌注損傷，重新恢復(fù)心肌細(xì)胞的功能已成為目前心肌保護(hù)的研究熱點(diǎn)之一。目前有研究表明間歇性低氧適應(yīng)，類似缺血預(yù)適應(yīng)和長(zhǎng)期高原低氧適應(yīng)，具有明顯的心臟保護(hù)作用，表現(xiàn)為增強(qiáng)心肌對(duì)缺血/再灌注損傷的耐受性、抗細(xì)胞凋亡、限制心肌梗死面積和形態(tài)學(xué)改變及促進(jìn)缺血/再灌注心臟舒縮功能的恢復(fù)[8]，但具體機(jī)制目前尚不明確。

在缺血再灌注損傷中，低氧是HO-1的強(qiáng)誘導(dǎo)因素。HO-1作為一種新型的心肌保護(hù)因子通過(guò)催化血紅素降解，其產(chǎn)物的抗炎、抗氧化、抗凋亡和血管舒張等作用在心血管疾病中發(fā)揮著重要的保護(hù)作用[9-11]。HO-1是血紅素氧合酶（HO）的同工酶之一，可被多種刺激因素如：缺血再灌注、熱休克、重金屬和低氧等誘導(dǎo)表達(dá)升高。近年來(lái)一些研究結(jié)果顯示，NO對(duì)血紅素分子具有親和力，都能激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，調(diào)節(jié)NO的產(chǎn)生舒張血管的作用。HO-1蛋白能通過(guò)催化血紅素降解代謝產(chǎn)物，其代謝產(chǎn)物具有的抗凋亡抗炎性反應(yīng)外。除此之外，在體內(nèi)和體外均發(fā)現(xiàn)HO-1的表達(dá)能抑制血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HO-1作為單磷酸腺苷激活的蛋白激酶（AMPK）的下游產(chǎn)物，通過(guò)抑制心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，能減輕內(nèi)皮素及AngⅡ所致的心血管重構(gòu)。從而達(dá)到抑制心肌細(xì)胞肥大的作用，并通過(guò)抑制心肌肥大，延緩心室重構(gòu)的提高轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子蛋白表達(dá)，而通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子信號(hào)通路調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激，提高谷胱甘肽等抗氧化因子表達(dá).這些研究都明顯涉及到對(duì)血管損傷后重建的關(guān)鍵[12-14]，在許多疾病中起著重要的保護(hù)作用，但相關(guān)作用的機(jī)制還不完全清楚。

本實(shí)驗(yàn)建立間歇性低氧模型及缺血再灌注模型，探討HO-1在間歇性低氧對(duì)心肌缺血再灌注的影響。通過(guò)監(jiān)測(cè)各組大鼠心室舒張期末容積、左心室收縮期末容積、左心室射血分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧處理后，左室舒張末期容積及收縮末期容積明顯下降，射血分?jǐn)?shù)提高，心功能得到改善。于此同時(shí)，通過(guò)Western-Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)間歇性低氧處理后HO-1蛋白表達(dá)升高。表達(dá)增高的HO-1蛋白通過(guò)抑制心肌肥大及代謝產(chǎn)物抗凋亡抗炎性反應(yīng)的作用延緩大鼠心肌重構(gòu)，改善心功能，從而在大鼠心肌缺血再灌注損傷中起到保護(hù)作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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