MSPD-GC/MS/MS檢測發酵乳中氨基甲酸乙酯的含量

周鑫達 畢曉麗 張書芬

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）是發酵型食物天然產生的污染物，在發酵食物中廣泛存在，被國際癌癥研究機構評定為2A類對人體可能致癌的物質。發酵乳是人日常生活中常見的食品，發酵乳中的EC含量雖然不高，但仍存在一定的風險?，F行的國家食品安全標準GB 5009.223- 2014《食品安全國家標準 食品中氨基甲酸乙酯的測定》和中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準SN/T 0285-2012《出口酒中氨基甲酸乙酯殘留量檢測方法 氣相色譜-質譜法》主要是針對酒類產品和醬油中EC的檢測，還無適用于發酵乳的標準，因此有必要建立對其中的EC含量進行監測的方法。本研究采用基質分散固相萃取（MSPD）結合氣相色譜串聯三重四級桿質譜 （GC- MS/MS）檢測發酵乳中的氨基甲酸乙酯，具有快速、準確、高效，可滿足日常檢測的需求。

設備與材料

儀器設備。Thermo TSQ 8000 Evo/1310型氣相色譜-質譜聯用儀，梅特勒-托利多儀PL602E/02型電子天平，SRATORIUS CP225D型分析天平，湘儀TGL- 20M高速冷凍離心機，IKA VORTEX GENIUS 3渦旋混合儀，MILLI- Q超純水機，Biotage TurboVap LV型氮吹儀，梅特勒-托利多儀Five Easy Plus 28型pH計。

主要試劑。氨基甲酸乙酯（EC）標準品：Dr. Ehernstorfer，純度98.5%；氨基甲酸乙酯- D5（EC- D5）標準品：Dr.Ehernstorfer，純度99.6%。乙酸乙酯（色譜純），乙腈（色譜純），鹽酸（優級純），氯化鈉（分析純），超純水，N-丙基乙二胺（PSA）。

標準溶液配制。標準儲備液的配制：分別稱取折算純度后的氨基甲酸乙酯和氨基甲酸乙酯- D5標準品10mg（精確到0.01mg）至10mL容量瓶中，乙腈溶解，定容，配置成1000mg/L的標準儲備液，于- 18℃下避光保存。

標準使用液的配制：移取100μL氨基甲酸乙酯標準儲備液，乙腈稀釋至10mL，配制成10mg/L的標準使用液。移取10μL氨基甲酸乙酯- D5標準儲備液，乙腈稀釋至10mL，配制成1mg/L的標準使用液。

標準曲線用乙酸乙酯：乙腈（V：V=1：3）配制，氨基甲酸乙酯的質量濃度為：10，20，50， 100，200，500μg/L，內標質量濃度為50μg/ L。

實驗方法

樣品處理。移取約樣品5g，加入100ng氨基甲酸乙酯- D5內標，渦旋混勻，用3mol/L的鹽酸調節pH值為4.50±0.1左右，8000r/min，4℃冷凍離心5min，移取上清液于50mL離心管中。沉淀再次用5mL水振搖提取，離心后合并上清液，備用。

凈化。備用液離心管中加入2g氯化鈉、5mL乙酸乙酯，渦旋震蕩5min，移取有機相層于10mL氮吹定量管中；水相再次用5mL乙酸乙酯提取，合并有機相。室溫下氮吹至約0.5mL（不可吹干），用乙腈定容至2mL，加入200mg PSA，渦旋混勻，沉淀后取上清液過有機膜供儀器分析。

儀器條件。T h e rm o T S Q 8 1 0 0 E vo/1310三重四級桿氣質聯用儀，進樣口溫度230℃，不分流進樣；色譜柱：TGWAXMS（30m×0.25mm×0.25μm），初始溫度50℃，保持1min，再以8℃/min升溫至180℃，保持0min，最后以30℃/min升溫至240℃，保持5min；進樣量2μL；高純氦氣（He）為載氣，流速1.0mL/min，傳輸線溫度250℃ ，離子源溫度280℃ ，四級桿I溫度150℃，四級桿II溫度150℃；猝滅氣（He）流速2.25mL/min，碰撞氣（N2）流速1.5mL/min。電離方式：EI源，電離能量70eV，監測離子對m/z 62/44（16eV） 、m/z 62/45（20eV），m/ z 64/44（18eV） 、m/z 64/46（18eV）；溶劑延遲8min。

定性定量方法。定性方法：以m/z 62為EC母離子經裂解后得到的碎片離子m/z 44、m/ z 45，豐度比為100：49為參照，樣品與標準品的保留時間一致，且碎片離子豐度比與標準品符合（允許±20%偏差），可確證為目標分析物。以m/z 64為EC- D5母離子經裂解后得到的碎片離子m/z 44、m/z 46，豐度比為100：67為參照，樣品與標準品的保留時間一致，且碎片離子豐度比與標準品符合（允許±20%偏差），可確證為內標物。

定量方法：以m/z 62/44；m/z 64/44為定量離子對，內標法定量測定，縱坐標為豐度值比值，橫坐標為系列濃度的標準溶液，建立標準工作曲線。

結果與分析

前處理條件選擇。發酵乳中蛋白質、脂肪、糖類等含量較高，基質復雜、干擾較多，要測定其中的氨基甲酸乙酯需要先對樣品進行凈化處理，多數文獻采用直接提取法和SPE固相萃取法前處理，本實驗采用等電點沉淀-基質固相分散萃取法前處理。比較這三種方法，結果發現直接提取法雜質干擾較嚴重回收率較低，SPE固相萃取法與等電點沉淀-基質固相分散萃取法均能達到較好的凈化效果，但回收率不高，所以考慮加入同位素內標以提高回收率及穩定性。其次SPE固相萃取法需要使用的有機試劑量大，固相萃取柱成本較高，操作步驟多，檢測效率低。而等電點沉淀-基質固相分散萃取-內標法消耗試劑量小，成本低，檢測效率高，所以選用等電點沉淀-基質固相分散萃取-內標法進行樣品前處理實驗。

質譜參數優化及標準曲線。運用AUTOSRM優化質譜參數，得到EC的特征母離子有m/z 44、62、74，EC- D5的特征母離子有m/z 44、64、74。選擇豐度最大的m/z 62作為EC的母離子，m/z 64作為EC- D5的母離子，進行裂解能量優化實驗，結果如圖1所示。

從圖1中可以看出，m/z 62離子在裂解能量為16eV的時候，能夠得到豐度最大的子離子m/z 44，豐度比100：49。m/z 64離子在裂解能量為18eV的時候，能夠得到豐度最大的子離子m/z 44，豐度比100：67，結果見圖2。

所以選用m/z 62/44（16e V ） 、m/ z 62/45（20eV）和m/z 64/44（18eV） 、m/z 64/46（18eV）進行SRM監測掃描，SRM色譜圖結果見圖3。

在上述優化條件下，將系列標準溶液依次進樣，內標法建立標準工作曲線，結果見圖4。由圖4可知，EC在10～500μg/L的范圍內呈良好線性關系，標準曲線回歸方程為y=0.02235x+0.0646，相關系數R2=0.9998。

檢出限與回收率。標準工作曲線方程回歸系數R2=0.9998。根據檢出限定義單位時間內進入檢測器的組分所產生的信號等于3倍基線噪聲時的量。

稱取六份發酵乳樣品各5.0g，加標20μg/ kg，按照實驗方法處理，上機分析。計算得到檢出限濃度為1.25μg/L，折算為質量濃度為0.5μg/kg，數據結果見表1。

當加標量為20μg /kg時，回收率在93.6% ～104.5%之間，相對標準偏差RSD=4.1% ，具體數據見表2。

通過前處理條件篩選，采用等電點沉淀-基質固相分散萃取-內標法提取凈化，氣相色譜-串聯質譜（GC- MS/MS）法測定發酵乳中的氨基甲酸乙酯含量的方法。相比其他方法該方法處理簡單，有效較少雜質干擾，試劑用量少，回收率穩定。該方法的線性方程回歸系數R2=0.9998，方法檢出限0.5μg/kg，當加標量為20μg/kg時，回收率在93.6%～104.5%之間，相對標準偏差RSD =4.1%， 能滿足發酵乳中氨基甲酸乙酯檢測的需求。