南海刺參皂苷的分離純化及其抑瘤活性研究

張蕊 孫宏偉 徐成

南海刺參皂苷的分離純化，分析和評價南海刺參皂苷的對腫瘤的抑制效果，為利用海參皂苷研制高效抗腫瘤藥物創造條件。方法：先后利用大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析和HPLC對南海海參皂苷進行了純化，并利用腫瘤細胞培養的方法對純化組分的抗腫瘤活性進行了測定。結果：海參皂苷對小鼠肉瘤細胞系S180、人結腸癌細胞系Caco- 2和人宮頸癌細胞系Hela的均有明顯的生長抑制作用。結論：本研究為南海海參皂苷在預防和治療腫瘤中的應用提供了理論依據，同時也為南海海參中生物活性物質利用提供了新的思路。

海參具有較高的營養價值和膳食補充。在海參的壁和內臟中，可分泌一些活性物質，即海參皂苷。海參皂苷是海參的主要次生代謝產物，是化學防御的物質基礎。具有抗腫瘤、抗真菌、抑制細胞生長、免疫調節和溶血等多種生理和藥理活性。海參皂苷的分離純化及其藥物研究已引起人們的廣泛關注。采用大孔樹脂柱層析、硅膠柱層析和半制備型HPLC對刺參皂苷進行分離純化，并對純化組分的抗腫瘤活性進行了研究。

材料與方法

材料。南海海參市售，由中國青島海洋大學對樣品進行種屬鑒定。癌細胞是由北京維通利華動物有限公司提供的小鼠肉瘤S180細胞株、人結腸癌細胞系Caco- 2和人宮頸癌細胞系Hela。

實驗方法

（1）南海海參總皂苷的制備

10kg粉碎de 新鮮南海海參，用60%乙醇冷浸5次，每次3天，減壓回收乙醇提取物得清膏。將流浸膏均勻分散于水中，裝入預處理后的HP - 20大孔樹脂柱中，分別用水、80 %乙醇溶液和95 %乙醇溶液洗脫，收集80%乙醇洗脫液，減壓回收得到粗總皂苷。 粗總皂苷通過氯仿∶甲醇∶水梯度洗脫的正相硅膠柱層析進一步純化， 溶液的梯度為10∶1∶0.1到7 ：3 ：0.3。用硅膠板薄層色譜法檢測洗脫組分后，再用半制備型HPLC對流動度相同的洗脫組分進行合并純化。色譜柱為：A A 12S0 5- 2510W T O D S C 8，流動相為甲醇：水，流速為1.5毫升，最小檢測波長為205nm。

（2）細胞培養

S180和Hela細胞培養于含10%新生牛血清的RPMI-1640培養基，Caco- 2培養于含10%胎牛血清的MEM培養基，其中均含2%的青/鏈霉素。細胞置于37℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

（3）腫瘤細胞活力測定

收集對數生長期的腫瘤細胞，按照S180（5×04/mL）、Caco-2（2.5×104/mL）和Hela（2×104/mL）調整細胞密度，96孔板每個孔100μL/，對照組用水培養，每組3個重復，培養時間為48、72h。采用MTT法測定吸光度OD570值。細胞存活率（%）=（樣品組OD570/正常對照組D570）×100。

統計學方法。統計學處理數據以平均數±標準差表示，采用R3.4.1軟件t檢驗進行組間差異分析，以p<0.05為差異有顯著性。

結果

采用質譜法測定了南海海參5.47%的皂苷含量。高子陽研究了11種市售海參和8批干海參中總皂苷的含量。結果表明，海參總皂苷含量在3.16 %～5.27%之間，結果顯示南海海參總皂苷含量明顯高于其他種類的海參。南海海參皂苷對3種腫瘤細胞活力的影響見表1所示。經4μg/mL以上的海參皂苷處理后，三種癌細胞的生長均受到顯著的抑制，抑制作用與處理時間成正比。其中，在樣品作用72h后，海參皂苷對三種癌細胞細胞存活率的半數抑制濃度（IC50）分別為7.17、9.78和8.03μg/mL，是一種優良的海參皂苷來源物種。

結果表明，南海海參皂苷含量豐富，體外增殖抑制活性顯著高于其他海參，可作為海參皂苷的良好生物來源。海參皂苷在南海的抗腫瘤作用可能與提高機體免疫力和抗氧化水平有關。本研究為海參皂苷在腫瘤防治中的應用提供了理論依據，也為低值海參生物活性物質的高價值利用提供了新的思路。海參的抗腫瘤作用的分子機制仍需進一步研究。