傳統方法與分子生物檢測方法檢測結核病的比較研究

喬相練

結核病是結核分枝桿菌導致，是傳染性疾病，在世界范圍內具有高發生率和死亡率，對人類健康造成了嚴重化的威脅。隨著防治結核病工作的開展，我國結核病疫情得到有效的控制，發病率下降，但近年來，有些地區的結核病發生出現了回升趨勢，引起了學者的高度重視[1]。作為重點防治的傳染病，結核病的早期防治主要依靠實驗室診斷，發現傳染源，確診結核病，實施治療。結核病傳統的檢測方法是痰中結核桿菌檢測，做痰涂片和痰培養，但由于周期較長，不能滿足臨床需要[2]，因此，需要一種新的檢測方法。本文選取2016年1月～2017年1月在本院就診的疑似結核病90例患者，對比分析了傳統檢測方法和分子生物檢測方法，結果如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月～2017年1月在本院就診的疑似結核病患者90例作為研究對象，男50例，女40例，年齡31～74歲，平均年齡（45.4±3.6）歲，入選患者均對本次研究知情，在參與研究同意書上簽字。

1.2 方法 儀器：收集90例患者的痰液標本，使用儀器是美國伯樂CFX96熒光定量PCR檢測儀，高倍顯微鏡。

標本處理：在采集的痰液標本中，加入4%NaOH溶液，劑量是痰液的4倍，然后搖勻，在室溫下，靜止放置30 min，液化，取1 ml放入離心管中，在離心機中離心5 min，轉數是12 000 rpm，去除上清液，沉淀后，加入1 ml無菌生理鹽水，打勻，再次放入離心機中離心5 min，轉數是12 000 rpm，重復洗滌2次[3]。沉淀后加入50μDNA提取液，充分混合均勻后，提取液體中與水不相溶的物質，提取過程需要使用加樣器充分混合均勻后進行[4]。若出現吸管頭嘴太細不能吸取或堵塞吸頭，要使用未被污染的，將吸管頭嘴部減去一段，然后實施金屬浴10 min，離心5 min，12 000 rpm。

檢測方法：所有標本均使用濃縮集菌涂片抗酸染色顯微鏡檢查，熒光定量PCR檢測。方法是取單份PCR反應管，將處理后的保本直接加入其內，8 000 rpm離心5 s，將反應管放入PCR檢測儀中，擴增，在93℃下2 min預變性，再93℃45 s，55℃120 s，做30個循環后放入33℃環境中保溫，PCR反應后熒光監測，在PCR試管充分的冷卻到33℃，迅速將擴增后的反應管放入熒光檢測儀中，讀取并記錄，熒光激發波長是487 mm，檢測波長是525 mm。

質量控制：陰性質控品的增長曲線未表現出S型，或者Ct值是空白，陽性質控品的增長曲線表現出S型，且強陽性質控品定量參考值為1×102基因拷貝/ml至2×104基因拷貝/ml。

結果判斷：陰性是定量值＜5.000E+02，陽性是定量值＞5.000E+02。

1.3 統計學方法 本研究數據均用SPSS 18.0統計軟件處理，計數資料用例數（n）表示，計數資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

傳統方法的痰涂片檢查診斷陽性56例，陽性率62.2%，分子生物檢測方法的熒光定量PCR診斷陽性74例，陽性率82.2%，傳統方法的痰涂片檢查陽性率低于分子生物檢測方法的熒光定量診斷陽性率，兩種檢測方法存在差異具有統計學意義（χ2=8.792，P=0.002）。且分子生物檢測方法的熒光定量PCR與痰涂片陽性符合率為75.6%（56/74），見表1。

表1 傳統方法與分子生物檢測方法對比Table 1 Comparison of traditional methods and molecular biological detection methods

3 討論

結核病是結核桿菌引起的慢性傳染性疾病，是一種全球性疾病，近年來，結核病的發病率呈現出再次升高的趨勢，給全球結核病的防治提出了新的挑戰。由于感染結核桿菌后沒有明顯的癥狀或體征，僅PPD試驗結果為陽性，因此，結核病的診斷成為了臨床研究的重點，是結核病防治工作的重點。以往，對于結核病的診斷，主要是根據患者的臨床癥狀和實驗室檢查結果確診，但由于一些患者的結核病無明顯癥狀體征，從而給臨床診斷帶來了一定的難度。實驗室對于結核病的診斷主要是根據細菌學涂片和痰培養。痰涂片檢查方式不僅能夠明確結核病的傳染源，而且檢查費用低廉，符合我國的國情，但檢出陽性率偏低，進而失去了診斷的準確性，但在當前結核病的實驗室檢查中，痰培養仍是診斷金標準，特別是藥敏實驗結果，對患者的臨床用藥和耐藥性檢測等方面起到了重要作用，不過檢測時間加長，因此，需要改進。

隨著分子生物學技術的發展，結核病分子流行病學的研究，耐藥性的研究新技術的建立，分子生物學技術在結核病研究中廣泛的應用，PCR技術已經在結核病實驗室診斷中開展應用[5]。PCR技術是利用一對結核分枝桿菌的特異性引物，一條結核分枝桿菌特異性熒光探針，配以PCR反應液，耐熱DNA聚合酶，四種核苷酸單體等成分，體外擴增發檢測結核分枝桿菌[6-7]。

分子生物檢測方法中的熒光定量PCR技術的實施是在PCR反應體系中加入熒光基團，監測熒光信號的累積，監測PCR進程，通過Ct值和標準缺陷測定樣品中的DNA進程，1 d內即可得出檢驗結果[8-9]。由于PCR擴增是在密閉的狀態下進行，從而避免了擴增物的污染，減少了假陽性結果的出現，靈敏度和特異性較高[10]。

本次研究中收集了90例疑似患者的痰液標本，對比傳統方法和分子生物檢測，結果發現傳統方法的痰涂片檢查診斷陽性率62.2%，分子生物檢測方法的熒光定量PCR診斷陽性率82.2%，兩種檢測方法存在差異具有統計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，在結核病的檢測中，分子生物檢測方法簡便快捷，靈敏度高，具有較高的診斷和鑒別診斷價值，適合在臨床推廣應用。

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[3] 李榮輝,羅又瑋.4種檢測方法在診斷結核病中的價值分析[J].臨床合理用藥雜志,2016,9(23):96-98.

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[6] 張威,李國蘭,徐杰,等.3種結核病快速診斷新技術與傳統方法的對比分析[J].中國衛生檢驗雜志,2016,27(22):3245-3247.

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[10]鮑磊,李濤,盧水華.全血?干擾素釋放試驗在兒童和成人中的結核病診斷價值[J].微生物與感染,2014,9(1):21-27.