血清學篩查聯合無創產前檢測在胎兒常見非整倍體篩查中的應用

葉強，胡勤，鐘強，梁屹，韋懿

伴隨著二胎政策的開放，高齡孕婦人數顯著增加，研究發現孕婦年齡與胎兒染色體疾病發生率呈正相關[1]。單一的血清學篩查，以其較低的檢出率、較高的漏診率和假陽性率，勢必達不到產前篩查的目的[2]。在川南地區，常以血清學篩查聯合染色體核型分析進行產前篩查。但是，這種侵入性方法獲取胎兒組織（如絨毛活檢、羊膜腔穿刺、經腹臍靜脈穿刺），會造成0.5%～1%的胎兒流產，同時引起孕婦和家人的焦慮、恐懼等[3]。并且部分介入性產前診斷禁忌證者（先兆流產、發熱、有出血傾向、感染未愈等）、懷有珍貴兒的孕婦等拒絕侵入性診斷，進而導致唐氏綜合征和愛得華斯（Edwards）綜合征患兒的出生，給家庭及社會造成嚴重的經濟壓力設精神壓力。無創產前檢測（NIPT）檢測孕婦外周血中胎兒游離DNA（cell free fetal DNA，cff DNA）[4-6]，具有無創傷性、高的檢出率和低的假陽性率、適用的孕周范圍較大、臨床所需信息少，流程較簡單，質量控制相對容易等優點[7]。本文旨在研究血清學篩查聯合無創產前檢測篩查胎兒唐氏綜合征和愛得華斯（Edwards）綜合征，并對結果進行比較分析。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年9月～2016年9月本院婦產科門診就診且自愿進行血清學篩查和NIPT檢測的孕婦364例，詳細詢問并記錄孕婦年齡、孕周、末次月經時間、孕產次和既往分娩史。

1.2 方法

1.2.1 血清學篩查 抽取孕婦2 ml靜脈血定量檢測甲胎蛋白（AFP）和絨毛膜促性腺激素（HCG），結合孕婦的年齡、采血時的準確孕周，應用計算機軟件檢測胎兒患某些疾病的危險系數。本院T21臨界風險為1/1 000≤T21風險值＜1/270，高風險為≥1/270，T18臨界風險為1/1 000≤T18風險值＜1/350，高風險為≥1/350。

1.2.2 無創產前檢測和數據分析 采取5 ml孕婦外周血于Streck Cell-Free DNA BCT采血管中，采用兩步離心法。第一步，在4℃，1 600 g離心15 min，吸去上清血漿，轉移至置于冰盒上的2.0 ml離心管，吸掉多余的血漿，吸取白細胞保存。第二步，初步分離的血漿在4℃，16 000 g離心10 min，分裝至置于冰盒上的2.0 ml離心管。取400 ml血漿利用磁珠法提取，剩余部分保存于-80℃。將提取的DNA進行文庫構建、定量，最后用Bio Seq 4000測序儀進行全基因組測序。

測序結束后，運用《無創產前數據分析管理軟件》對測序數據進行分析，得到樣本的21號染色體、18號染色體、13號染色體的Z值，根據每個樣本的Z值判斷樣本的檢測結果。其核心算法采用通用函數計算Z值，比對、過濾所得到每個樣本的唯一匹配reads數即 unique reads數，并計算每個樣本每條染色體的unique reads數占該樣本所有染色體unique reads數百分比%chrN，即reads ratio值。胎兒染色體非整倍體的陽性判斷值及參考區間設置如下：陰性-3≤Z＜1.96，臨界（充抽血復查）1.96≤Z≤3，陽性Z＞3。

1.2.3 無創產前檢測結果驗證 對所有NIPT檢測孕婦進行電話隨訪，記錄新生兒出生后有無外貌、結構及智力發育異常等。

1.3 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清學篩查各年齡組高風險和臨界風險發生率 將孕婦按照年齡分為20歲以下、20～24歲、25～29歲、30～34歲、35～39歲、40～44歲、45以上這8個組。35歲以下各組之間和35以上各組之間血清學篩查高風險和臨界風險沒有顯著差異；35歲以上的血清學篩查高風險和臨界風險67.65%（23/34）相對于35歲以下36.26%（153/422）有顯著性差異（P＜0.05），見表1。即35歲為臨界點，35歲以上高齡孕婦發病率急劇上升，見圖1。

表1 各年齡組血清學篩查發生率Table 1 Serological screening rates in all age groups

圖1 各年齡組血清學篩查發生率Figure1 Serological screening rates in all age groups

2.2 無創檢測與血清學檢測的比較 各個年齡組血清學篩查的臨界風險和高風險的孕婦，進行無創產前檢測，結果均為陰性，隨訪結果新生兒外貌、結構均無明顯異常，智力發育良好，見表2。血清學檢測為低風險的孕婦，NIPT結果也為陰性（表2中數據未例出）。ROC曲線（receiver operating characteristic curve）表明，NIPT相對于血清學篩查，有更高的準確率，見圖2。

3 討論

不進行產前診斷和治療性流產的情況下，發達國家DS胎兒的出生率為1‰～2‰，且伴有嚴重的智力障礙。其中，95%的病例存在21號染色體的不分離，4%易位，1%嵌合[8]。我國是出生缺陷的高發國，目前我國出生缺陷的發生率約在5.6%，每年新增出生缺陷數約90萬例。染色體疾病是最為嚴重的出生缺陷之一。其中，21三體、18三體約占圍生期出生缺陷的0.15%，占圍生期常染色體非整倍體的95%左右。目前公認最常用、最有效的妊娠早期篩查方案是PAPP-A（血漿蛋白A）、游離β-HCG（人絨毛膜促性腺激素β亞單位）和NT（頸背皮膚透明帶厚度聯）聯合篩查[9]。川南地區，主要采用兩聯血清學篩查。在本文中，血清學篩查35歲以上高風險、臨界風險發生率顯著與35歲以下。Eichenlaub-Ritter[10]提出，原因可能是隨著年齡增長，卵母細胞老化。Kline[11]提出卻是由于延遲受精和精子老化假說。

表2 NIPT與血清學篩查診斷意義的比較Table 2 Comparison of diagnostic significance between NIPT and serological screening

圖2 無創與血清學檢測結果比較Figure2 Comparison of Non-invasive and serological test results

唐氏綜合征和愛得華斯（Edwards）綜合征占出生缺陷比例如此之高，且這種胎兒的出生會造成嚴重的負擔，單一的血清學篩查，是不能滿足要求的。NIPT T21檢出率＞99%、T18、T13檢出率約為98%、99%，且假陽性率約為0.13%[12]。本文中，檢測結果均為陰性，未發現陽性結果，可能是樣本數量在一定程度上還是偏少。雖然NIPT有極高的檢出率、低的假陽性率，但在檢測染色體平衡易位、嵌合體及環狀有困難[13]。NIPT作為一種主要的篩選新方法，孕婦不論其年齡大小，均應知曉篩查風險以及其性質、范圍和意義[14-16]。

綜上所述，本文中血清學篩查表明，在川南地區，孕婦在35歲以上T21、T18高風險和臨界風險率顯著增加。NIPT檢測結果表明，相對于傳統的孕中期血清學篩查相比較，具有高特異性和敏感性，且避免了侵入性檢測，更能為孕婦接受。由于無創DNA檢測價格偏高，所以建議在川南地區，35歲以下孕婦血清學檢測為高危或臨界，應該進行無創檢測；35歲以上，可以直接進行無創檢測。

[1] Donner C,Daelemans C,Ceysens G.Prenatal screening:the example of Dowen,s syndrome screening[J].Rev Med Brux,2015,36(4):207-211.

[2] 邊旭明.胎兒染色體非整倍體的無創DNA產前檢測[J].實用婦產科雜志,2013,29(5):330-333.

[3] 賈蓓,鐘梅.高通量測序技術在無創產前檢測中的應用[J].中國實用婦科與產科雜志,2015,31(9):807-810.

[4] Lo YM,Corbetta N,Chamberlain PF,et al.Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J].Lancet,1997,350:485-487.

[5] PalomakiGE,KlozaEM,Lambert-MesserlianGM, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect down syndrome an international clinical validation study[J].Genet Med,2011,13(11):913-920.

[6] Chiu RW,Akolekar R,Zheng YW,et al.Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing:large scale validity study[J].BMJ,2011,342:c740.

[7] GIL MM,Quezada MS,Revello R,et al.Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis[J].Ultrasound in Obstetrics and Gynecology,2015,45(3):249-266.

[8] Howard S Cuckle.Primary prevention of Down’s syndrome[J].Int J Med Sci,2005,2(3):93-99.

[9] Nicolaides KH.Screening for fetal aneuploidies at 11 to 13 weeks[J].Prenat Dingn,2011,31(1):7-15.

[10]Eichenlaub-Ritter U.Genetics of oocyte ageing[J].Maturitas,1998,30:143-169.

[11]Kline J,Levin B.Trisomy and age at menopause:predicted associations given a link with rate of oocyte atresia[J].Paediatr Perinat Epidemiol,1992,6(2):225-239.

[12]Anne Flock,Ngoc-Chi Tu,Anna Ruland,et al.Non-invasive prenatal testing(NIPT):Europe’s first multicenter post-market clinical follow-up study validating the quality in clinical routine[J].Arch Gynecol Obstet,2017(2):1-6.

[13]李燕芳,張蘭珍,田耕,等.胎兒游離DNA用于無創產前檢測21、18、13三體綜合征的臨床研究[J].中國婦產科臨床雜志,2015,16(2):126-129.

[14]Benn P,Borrell A,Chiu RW,et al.Position statement fromthe Chromosome Abnormality Screening Committee on behalf of the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis[J]. Prenat Diagn,2015,35:725-734.

[15]Schmid M,Klaritsch P,Arzt W,et al.Cell-Free DNA testing for fetal chromosomal anomalies in clinical practice:Austrian-German-Swiss recommendations for non-invasive prenatal tests(NIPT)[J].Ultraschall Med,2015,36:507-510.

[16]Kagan KO,Sonek J,Wagner P,et al.Principles of first trimester screening in the age of non-invasive prenatal diag-nosis:screening for chromosomal abnormalities[J].Arch Gynecol Obstet,2017,296(4):635-643.