響應面試驗優化中式香腸天然復合抗氧化劑的配方

羅愛國，胡變芳

1(山西藥科職業學院 食品工程系，山西 太原，030031) 2(晉中學院 生物科學與技術學院，山西 晉中，030619)

中式香腸是我國消費者最受歡迎的肉制品之一，但因其脂肪含量一般≥20%，易發生脂質過氧化產生異味而影響香腸品質及消費，尤其是在高溫(45～60 ℃)干燥條件下[1-2]。在工業生產中主要通過添加合成抗氧化劑來減小脂質過氧化，以改善香腸品質以及延長貨架期。隨著越來越多消費者對合成抗氧化劑(如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯等)安全問題的擔憂，天然抗氧化劑替代合成抗氧化劑應用于食品工業已成為研究熱點[3]。但單一的天然抗氧化劑的效果弱、效率低[4-5]，而抗氧化活性成分間復配的協同增效作用可有效提高抗氧化能力[6-7]。

花椒葉為蕓香科植物花椒的葉子，富含蛋白質、碳水化合物、膳食纖維、維生素、礦物質等營養物質，是一種傳統的純天然食品[8]；且花椒葉含有抗氧化活性成分如黃酮、多酚、揮發油等[9-10]，LI等[11]發現花椒葉提取物可抑制腌制和干制銀鯉腌的脂質氧化。前期我們的研究也證實了花椒葉提取物能夠減緩食用油脂氧化，且與Vc具有協同增效作用[12]。花椒葉提取物具有抗氧化活性，能夠用于食品保鮮。

迷迭香提取物、抗壞血酸(Vc)是我國肉制品中允許使用的天然抗氧化劑。關于花椒葉提取物與迷迭香的協同作用以及Vc、花椒葉提取物與迷迭香提取物三者復合抗氧化作用的研究均未見報道。

本研究主要采用Central Composite試驗設計，以硫代巴比妥酸值(TBARS值)為響應值，考察了花椒葉提取物、迷迭香提取物以及Vc復合抗氧化劑在中式香腸中的保鮮效果，并優化復合抗氧化劑的配比，以期為中式香腸保鮮開發一種天然高效的食品抗氧化劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒葉，采集于山西省陽泉市盂縣；迷迭香提取物(質量分數：鼠尾草酚3.3%、鼠尾草酸5.3%、迷迭香酸5.5%)，南京澤朗醫藥公司；Vc(質量分數：99%)，東北制藥集團股份有限公司；95%體積分數食用乙醇(食品級)，常州啟迪化工有限公司；硫代巴比妥酸(TBA)，上海科豐化學試劑有限公司；1，1，3，3-四乙氧基丙烷(標準品)，武漢天植生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋(HH-2型)，常州國華電器有限公司；旋轉蒸發器(RE-52AA型)，上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(FreeZone型)，美國Labconco公司；絞肉機(SZ-12型)，中國杭州賽旭食品機械有限公司；高速斬拌機(SZ-80型)，中國杭州賽旭食品機械有限公司；紫外可見分光光度計(TU-1810)，北京普板通用有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒葉提取物的制備

采集的花椒葉用蒸餾水清洗后，經40 ℃真空干燥1 h，粉碎后過40目篩，經真空包裝后4 ℃冷藏備用。花椒葉提取物的制備依據羅愛國等[12]方法，并稍作修改。 20 g花椒葉粉末與200 mL體積分數為65%食用乙醇溶液混合于圓底燒瓶，60 ℃回流提取10 min，經減壓抽濾后得濾液；濾渣經100 mL的體積分數為65% 食用乙醇按上述方式再次回流提取，合并2次濾液得到花椒葉乙醇提取液。乙醇提取液在60 ℃下減壓濃縮到約20 mL，經真空冷凍干燥(真空度10 Pa, 冷阱溫度為-82 ℃)，得花椒葉提取物干粉(產率為84.5 mg/g)，經真空包裝后4 ℃冷藏備用。

1.3.2 中式香腸的生產工藝

參照YU等[13]的工藝制作，新鮮無骨冷鮮豬肉(去皮、結締組織、脂肪)和背脂分別被絞成5 mm肉末，根據表1配方制作香腸。香腸原材料被高速均質15 min，然后將香腸原料混合物分成若干份(約100 g/份)，分別將花椒葉提取物、迷迭香提取物及Vc按不同配比復合成抗氧化劑以隨機方式添加到香腸原料混合物中，將混合物高速斬拌30 min后，灌入豬腸衣，隔3 cm刺孔放氣，并結扎制成直徑(35±2) mm、長約為15 cm的香腸。將制好的香腸在50 ℃中烘烤48 h，然后在15 ℃車間晾掛熟化20 d，經真空包裝、貼標，在室溫下貯藏。以未添加抗氧化劑的香腸為對照，在貯藏期取香腸樣品測定硫代巴比妥酸值(TBARS)及進行感觀評價。所有試驗在不同的時間重復3次。

表1 中式香腸配方Table 1 Formulation of Chinese-style pork sausages

1.3.3 TBARS值測定

TBARS值采用趙建生等[14]的方法。取10.0 g香腸樣品，加入50 mL三氯乙酸混合溶液，均質3 min，真空抽濾后，移取5.00 mL濾液于具塞比色管中，加入5 mL TBA溶液，在90 ℃水浴中加熱40 min，冷卻至室溫后在12 000 r/min下離心5 min，取上清液加入5 mL三氯甲烷，搖勻，待靜置分層后，用紫外分光光度計測定上清液在波長538 nm處的吸光度值，同時做空白試驗。

用1，1，3，3-四乙氧基丙烷配制丙二醛標準溶液，按上述方法測定并繪制丙二醛標準曲線。

1.3.4 感觀分析

感官分析采用ZHANG等[2]的方法。感官評定小組由10名食品專業的教師與學生組成，并在評價前根據我國肉制品感觀評價標準(GB/T 22210—2008)進了專業培訓。香腸樣品經蒸煮15 min，取出冷卻到溫室，切成3 mm厚片，放在標有隨機數字的白色磁盤中，感觀評價在裝有熒光燈的獨立房間進行，每次測試時間相同。在評價不同樣品之間，評價小組成員用溫水漱口。評價方法采用9分制評分(評價標準見表2)，對香腸的感觀品質(色澤、氣味、滋味、質地及總體可接受性)進行評價。

表2 中式香腸感觀評價標準Table 1 Standard of sensory evaluationof Chinese-style sausages

1.3.5 天然復合抗氧化劑配比優化試驗

1.3.5.1 單因素試驗

根據課題組前期研究[12]以及有關文獻[11, 15-16]，單因素試驗中花椒葉提取物、迷迭香提取及Vc用量分別選取0.08、0.07及0.60 g/kg。單因素試驗按照1.3.2工藝制作中式香腸，測定香腸樣品貯藏第60天的TBARS值，考察花椒葉提取物用量(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 g/kg)、迷迭香提取物用量(0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g/kg)及Vc用量(0.00、0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05、1.20 g/kg)對TBARS值的影響。

1.3.5.2 復合抗氧化劑配比響應面優化試驗

在單因素考察試驗結果的基礎上，確定各抗氧化劑用量水平，采用Central Composite設計(CCD)試驗方案，按照1.3.2工藝生產中式香腸，測定樣品在貯藏第60天的TBARS值。對自變量A(花椒葉提取物用量)、B(迷迭香提取用量)及C(Vc用量)與響應值(TBARS值)關系進行二次多項式擬合回歸，建立函數關系，確定復合抗氧化劑最佳配比。

1.3.6 天然復合抗氧化劑在中式香腸中效果測定

將優化的用量配制復合抗氧化劑，按照1.3.2工藝制作中式香腸，分別在貯藏第0、15、30、45、60、75、90、105、120天取樣測定TBARS值，并評價貯藏第60天的香腸感觀品質。

1.3.7 統計方法

所有實驗重復3次。實驗結果以±SE形式表示。配方優化采用Design-Expert 8.06軟件進行試驗設計及回歸分析，并求極值。數據采用SPSS 18.0軟件進行方差分析，香腸的TBARS值及感觀評價用鄧肯多重比較來確定不同處理間的顯著性差異，以p≤0.05作為顯著性水平，以p≤0.01作為極顯著性水平；復合抗氧化劑配方驗證分析采用一般線性模型(GLM)，將處理和時間作為固定效應，重復作為隨機效應，進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 花椒葉提取物用量對中式香腸TBARS值的影響

固定迷迭香提取物用量為0.07 g/kg、Vc用量為0.60 g/kg，考察花椒葉提取物用量對中式香腸的TBARS值的影響，如圖1所示。

圖1 花椒葉提取物用量對中式香腸TBARS值的影響Fig.1 Effect of extract from Zanthoxylum bungeanum Maxim leaves on TBARS of Chinese-style sausage

由圖1可知，隨著花椒葉提取物用量的增加中式香腸的TBARS值逐漸降低。當花椒葉提取物用量增加至0.08 g/kg時，香腸TBARS值為0.65 mgMDA/kg；當用量繼續增加(≥0.10 g/kg)，相對應的香腸TBARS值間無顯著性差異(p>0.05)。因此，確定花椒葉提取物最佳用量為0.08 g/kg，將此用量作為Central Composite試驗設計中該因素的零水平。

2.1.2 迷迭香提取物用量對中式香腸TBARS值的影響

固定花椒葉提取物用量為0.08 g/kg、Vc用量為0.6 g/kg，考察迷迭香提取物用量對中式香腸的TBARS值的影響，如圖2所示。

圖2 迷迭香提取物用量對中式香腸TBARS值的影響Fig.2 Effect of Rosemary extract on TBARS of Chinese- style sausage

由圖2可知，迷迭香提取物用量增加至0.06 g/kg時，香腸TBARS值為0.61 mg MDA/kg；當其用量繼續增加(≥0.08 g/kg)，相對應的香腸TBARS值間無顯著性差異(p>0.05)。因此，確定花椒葉提取物最佳用量為0.06 g/kg，將此用量作為Central Composite試驗設計中該因素的零水平。

2.1.3 Vc用量對中式香腸TBARS值的影響

固定花椒葉提取物用量0.08 g/kg、迷迭香提取物用量0.07 g/kg，考察Vc用量對中式香腸的TBARS值的影響，如圖3所示。

圖3 Vc用量對中式香腸TBARS值的影響Fig.3 Effect of Vc on TBARS of Chinese-style sausage

由圖3可知，Vc用量增加0.45 g/kg時，香腸TBARS值為0.62 mgMDA/kg；當其用量繼續增加(≥0.60 g/kg)，相對應的香腸TBARS值間無顯著性差異(p>0.05)。因此，確定Vc最佳用量為0.60 g/kg，將此用量作為Central Composite試驗設計中該因素的零水平。

2.2 天然復合抗氧化劑配比響應面優化

2.2.1 CCD試驗設計方案及試驗結果

根據單因素考察試驗結果，確定花椒葉提取用量的零水平為0.8 g/kg，標準差為0.4；迷迭香提取物用量的零水平為0.6 g/kg，標準差為0.3；Vc用量的零水平為0.45 g/kg，標準差為0.2。抗氧化劑各因素用量范圍實際值及標準化值見表3。通過CCD試驗設計模型，采用響應面法對復合抗氧化劑配比進行優化，試驗方案及結果見表4。

表3 抗氧化劑各因素用量范圍實際值及標準化值Table 3 The dosage range actual value of various factorsfor antioxidants and standardized value

注：A為花椒葉提取物用量；B為迷迭香提取物用量；C為Vc用量。

表4 復合抗氧化劑配比優化的響應面試驗設計及結果Table 4 Experimental design and result of the responsesurface analysis of composite antioxidant ratio optimization

注：A為花椒葉提取物用量；B為迷迭香提取物用量；C為Vc用量；Y為TBARS值。

2.2.2 回歸模型建立及方差分析

對響應面試驗結果進行回歸擬合，得到了貯藏期中式香腸的TBARS值與各抗氧化劑用量的回歸方程：Y=0.42+0.032A+0.044B-0.023C+0.005AB-0.044AC+0.034BC+0.051A2+0.044B2+0.023C2；式中，A為花椒葉提取物用量，g/kg；B為迷迭香提取物用量，g/kg；C為Vc用量，g/kg。并對回歸方程進行了方差分析，結果見表5。模型項p≤0.000 1，說明回歸方程的關系是顯著的；失擬項p>0.05，失擬項不顯著，說明該回歸模型擬合良好，可用該模型對試驗結果進行統計分析；調整回歸系數為R2=0.942 1，表明擬合的回歸方程能較好地反映各抗氧化劑用量與中式香腸的TBARS值之間的實際變化關系，可用來代替試驗真實點預測響應值。

3個因素中一次項A、B、C，二次項A2、B2、C2以及交互項AC、BC對響應值影響極顯著，AB項對響應值影響不顯著(p≤0.05)。這表明花椒葉提取物、迷迭香提取物及Vc用量均顯著影響貯藏期中式香腸的TBARS值，由各因素的F值可知，其對TBARS值影響的主次順序為：B>A>C，即迷迭香用量>花椒葉提取物用量>Vc用量；花椒葉提取物與Vc、迷迭香提取物與Vc之間均存在顯著的協同增效作用，但花椒葉提取物與迷迭香提取物間無顯著增效作用，其影響的主次順序為：花椒葉提取物用量×Vc用量>迷迭香提取物用量×Vc用量。

表5 響應曲面二次回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of response surface quadraticregression model

2.2.3 因素間的交互效應分析

為進一步考察因素間的交互效應，對有關變量經降維處理(分別將回歸方程中C、B和A項固定在零水平)，得回歸方程下如：YAB=0.42+0.032A+0.044B+0.005AB+0.051A2+0.044B2；YAC=0.42+0.032A-0.023C-0.044AC+0.051A2+0.023C2；YBC=0.42+0.044B-0.023C+0.034BC+0.044B2+0.023C2，圖4為相對應的響應面和等高線圖。響應面曲線越陡峭，表明該因素對響應值影響越大[17]，等高線圖越呈橢圓形，表明兩因素間的交互效應越大[16]。從圖4(a1、b1及c1)的響應面圖可直觀看出各因素對中式香腸TBARS值的影響大小，迷迭香提取物用量的影響最大，其次是花椒葉提取物，Vc的影響最小。這與回歸分析結果一致。

圖4-b2中，花椒葉提取物用量和Vc用量交互效應的等高線呈橢圓，說明兩因素間存在明顯的交互效應，花椒葉提取物用量為0.073 g/kg和Vc用量為0.52 g/kg時，TBARS值最小。圖4-c2中，迷迭香提取物用量和Vc用量交互效應的等高線趨近橢圓，說明兩因素間存在交互效應，迷迭香提取物用量為0.034 g/kg和Vc用量為0.65 g/kg時，TBARS值最小；圖4-a2花椒葉提取物用量和迷迭香提取物用量交互效應的等高線圖近似圓形，說明兩因素間不存在顯著的交互效應。可見花椒葉提取物與Vc、迷迭香提取物與Vc對中式香腸抗氧化作用具有明顯的增效作用。

圖4 各因素交互作用對中式香腸TBARS值影響的響應面及等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots shows the interactive effect of three factors on TBARS of Chinese-style sausage

2.2.4 復合抗氧化劑配比優化及效果驗證

采用Design Expert 8.0軟件對回歸函數模型進行極值分析，預測模型響應值(TBARS)，優化得三因素最佳組合為Z(-0.01，-0.47，0.17)，即花椒葉提取物用量為0.079 2 g/kg、迷迭香提取物用量為0.045 9 g/kg、Vc用量為0.484 g/kg，此時中式香腸樣品的TBARS最小值Y為0.398 1 mg MDA/kg。按此最優配比進行3次重復試驗驗證，測得中式香腸貯藏60 d的實際TBARS平均值為0.403 7 mg MDA/kg，與預測值接近程度達98.61%，表明該回歸模型能夠準確預測在中式香腸中復合抗氧化劑配比情況。

2.3 復合抗氧化劑在中式香腸中的抗氧化效果

2.3.1 香腸TBARS值的變化

香腸在較高的貯藏溫度、較多的脂肪含量、光線以及體系中的促氧化成分(如調味料、活潑金屬離子等)存在下極易發生脂質氧化。TBARS值被廣泛用來衡量肉制品脂質氧化的程度，TBA反應物的存在是由于脂質的過氧化物在自氧化第二階段被氧化成醛、酮等，其中丙二醛為主要產物之一[18]。在本研究中復合抗氧化劑對中式香腸貯藏期TBARS值的影響見圖5。在貯藏前，對照組香腸的TBARS值為0.39 mgMDA/kg，這個值接近于YU等[13]報道的0.35 mgMDA/kg，在貯藏120 d后增加到3.38 mg MDA/kg；而添加復合抗氧化劑的中式香腸在各個測定時間點上TBARS值均顯著低于對照組(p≤0.05)。中式香腸TBARS值在貯藏期的增加表明脂質過氧化的發生，而花椒葉復合抗氧化劑的添加能夠顯著延緩中式香腸的脂質氧化。在相似的研究中，殷燕等[15]發現在豬肉餅中添加不同劑量(0.03%、0.06%和0.09%)的迷迭香提取物，其抗脂肪氧化效果顯著高于對照組(p<0.05)，效果與添加0.02%的二丁基羥基甲苯相當；顧仁勇等[16]證實了Vc(添加量0.36 g/kg)與植酸等復配添加到湘西香腸具有顯著的抗氧化性，與對照組相比有較低的POV值和TBARS值。SOJIC等[19]認為當肉制品的TBARS值> 1 mg MDA/kg時開始腐敗，在本研究中對照組香腸TBARS值在貯藏30 d 達到0.93 mg MDA/kg；而處理組的TBARS值為0.20 mg MDA/kg，直到第75天達到1.05 mg MDA/kg。據FAN等[20]報道肉制品的TBARS限值是2 mg MDA/kg，在本試驗中添加復合抗氧化劑香腸在貯藏期120 d的TBARS值(1.72 mg MDA/kg)均小于2 mg MDA/kg，而對照組香腸在貯藏60 d的TBARS值達到了2.44 mg MDA/kg。這些結果均表明，復合添加劑在中式香腸中具有顯著的抗氧化效果，能夠延長香腸的貨架期45 d以上。

圖5 復合抗氧化劑對中式香腸貯藏期的TBARS值的影響Fig.5 Effect of composite antioxidant on TBARS value of Chinese-style sausage during storage

2.3.2 香腸感觀品質評價

感觀分析結果見表6，添加了花椒葉提取物復合抗氧化劑中式香腸在貯藏60 d的感觀屬性(色澤、氣味、滋味、質地及總體可接受性)顯著低于對照組(p≤0.001)。由2.3.1結果可知，對照組香腸在貯藏60 d時，其TBARS值為2.44 mg MDA/kg，且各感觀指標均表明香腸已經腐敗，故未作滋味評價。對照組香腸各感觀屬性值為4.11～4.27，表明香腸已不能被消費者接受；而添加復合抗氧化劑中式香腸感觀屬性值在6.45～6.83，各感觀屬性值均顯著高于對照組(p≤0.001)，受消費者喜愛。感觀評價結果表明復合抗氧化劑香腸處理組具有更好的感觀品質，與香腸的TBARS值研究結果總體一致。

表6 復合抗氧化劑對中式香腸貯藏第60天的感觀品質的影響Table 6 Effect of composite antioxidant on sensory quality of Chinese-style sausage on the 60 day

注：a-b表示同一列中的不同處理間的顯著性不同(p<0.05)；ND為未檢測。

3 結論

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