枸杞多糖脂質(zhì)體制備工藝

李妍，方芳，曹珂珂，王娣，許暉

(蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院， 安徽 蚌埠， 233030)

枸杞多糖組成為蛋白多糖——易溶于熱水、稀酸和稀堿溶液，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑的蛋白多糖，即由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6種單糖成分組成[1]。枸杞多糖為枸杞子的主要功能活性成分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、增強記憶力、防止遺傳損傷、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、降血脂、降血糖、耐缺氧等多種作用[2-4]。但枸杞多糖為水溶性物質(zhì)，生物利用度低，使枸杞多糖被開發(fā)成藥用劑型最大發(fā)揮其療效帶來很大困難。

脂質(zhì)體是一種人工膜，在水中磷脂分子親水頭部插入水中，脂質(zhì)體疏水尾部伸向空氣，攪動后形成雙層脂分子的球形脂質(zhì)體[5]。脂質(zhì)體可被用于藥物制備，利用脂質(zhì)體溶于細(xì)胞膜的性質(zhì)，將藥物送入細(xì)胞內(nèi)部[6]。脂質(zhì)體系統(tǒng)的基本特征主要表現(xiàn)為[7]：脂質(zhì)體雙分子層可以同時包埋親水和疏水性物質(zhì)，水分散性好；脂質(zhì)體的類生物膜結(jié)構(gòu)使其生物相容性好，無免疫抑制作用，毒性小；提高被包合物質(zhì)的穩(wěn)定性，保護(hù)定向至某些治療的靶器官或組織中，提高藥物的療效[8]。20 世紀(jì) 70 年代RAHMAN等[9]首先將脂質(zhì)體作為藥物載體應(yīng)用，脂質(zhì)體就以其高度的生物靶向性、長效緩釋性和低毒性引起了廣大藥劑工作者的關(guān)注。

本課題采用薄膜分散水化法探究包合工藝，改進(jìn)傳統(tǒng)的脂質(zhì)體制備條件，采用大豆卵磷脂和膽固醇對枸杞多糖進(jìn)行包合，以期提高枸杞多糖的穩(wěn)定性，提高其生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞多糖提取物(標(biāo)示量為60%)購于恒德堂原料提取廠；PBS緩沖液，實驗室自配；大豆卵磷脂(純度≥97%)，上海虹泉生物科技有限公司；膽固醇、三氯甲烷、(NH4)2SO4、苯酚、濃H2SO4(均為分析純)、一級純化水；實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)，安徽中華中佳科學(xué)儀器有限公司；電子天平AB323，上海海康電子儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；JK-500DB型數(shù)控超聲清洗器，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司； HH-501恒溫振蕩器，蘇州威爾實驗用品有限公司；電子天平Y(jié)P-B1003，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000B，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-1，金壇市杰瑞爾電器有限公司；ZEISS Merlin Compact場發(fā)射掃描電鏡，Carl Zeiss MERLIN Compact Germany；冷凍干燥機(jī)，Gold SIM International Group CO.LTD。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

稱取0.100 0 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，定容到100 mL，搖勻；再移取10 mL定容到100 mL，搖勻，得0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，再加入蒸餾水至2 mL，滴加5%苯酚溶液1 mL，再迅速滴加5.0 mL的濃H2SO4并搖勻。水浴鍋中沸水浴15 min，冷卻后在490 nm下測量吸光度[10]。以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=11.036x-0.001 5，R2=0.999 5。

1.3.2 枸杞多糖溶液的配制

稱取多糖提取物1.00 g，用1 000 mL水完全溶解，取出100 mL稀釋10倍后存儲待用。同上，配制濃度為0.100 0、0.050 0、0.033 3、0.025 0、0.020 0、0.016 7 g/L多糖PBS緩沖液各1 000 mL待用。按1.3.1方法測定吸光度，計算枸杞多糖包含率[11-12]。

(1)

注：制備脂質(zhì)體所加入枸杞多糖總量，稱量記為m總；被包合枸杞多糖測定：取枸杞多糖脂質(zhì)體置于透析袋中，通過在40℃下水化至脂質(zhì)膜脫落也即是破乳后得到澄清溶液，測定其多糖吸光度計算得枸杞多糖含量記為m1。

1.3.3 單因素實驗

1.3.3.1 以藥脂比(枸杞多糖與膜材的質(zhì)量比)為影響因素的制備

取1 g大豆卵磷脂和0.25 g膽固醇→加入15 mL三氯甲烷→超聲直至膜材充分溶解于三氯甲烷→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至出現(xiàn)膜層→揮去三氯甲烷→按照藥脂比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60混合→40 ℃下水化，至脂質(zhì)膜脫落(恒溫振蕩260 r/min)→測定吸光度→平行3次，計算包合率[13]。

1.3.3.2 以膜材比(大豆卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比)為影響因素的制備

取膜材大豆卵磷脂：膽固醇分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1→加入15 mL氯仿→超聲直至膜材充分溶解于氯仿→旋蒸直至出現(xiàn)膜層→揮去氯仿→按照藥脂比為1∶10混合→40 ℃下水化，至脂質(zhì)膜脫落(恒溫振蕩260 r/min)→測定吸光度→平行3次，計算包合率[14]。

1.3.3.3 以水化溫度為影響因素的制備

稱取1 g大豆卵磷脂和0.25 g膽固醇→加入15 mL氯仿→超聲直至膜材充分溶解于氯仿→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)直至出現(xiàn)膜層→揮去氯仿→按照藥脂比為1∶10混合→20、30、40、50、60、70 ℃下水化，至脂質(zhì)膜脫落(恒溫振蕩260 r/min)→測定吸光度→平行3次，計算包合率。

1.3.4 設(shè)計制備脂質(zhì)體的響應(yīng)面實驗

通過單因素實驗研究，可以看出藥脂比、膜材比和水化溫度對包合率有影響，故采用Box-Benhnken軟件[15]，以枸杞多糖包合率為響應(yīng)值，藥脂比、膜材比、水化溫度為實驗變量設(shè)計響應(yīng)面實驗。實驗因素水平編碼表如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因子與水平編碼Table 1 Factors and levels tested in response surface analysis

1.3.5 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面實驗結(jié)果，按照最佳制備工藝條件進(jìn)行脂質(zhì)體制備，實驗平行3次，取平均值，與預(yù)測值進(jìn)行比較[16]。

1.3.6 掃描電鏡觀察枸杞多糖脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)[17]

將枸杞多糖脂質(zhì)體冷凍干燥粉碎后真空鍍金70 s，用掃面電鏡通過不同的分辨率觀察枸杞多糖脂質(zhì)體表面和晶體結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖脂質(zhì)體制備單因素實驗分析

2.1.1 藥脂比對包合率的影響

在膜材比為4∶1，水化溫度40 ℃，藥脂比為1∶10、 1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60時進(jìn)行脂質(zhì)體制備，得到藥脂比與包合率的關(guān)系，如圖1所示，得出枸杞多糖脂質(zhì)體制備過程中包合率在藥脂比1∶30為轉(zhuǎn)折點，所以藥脂比應(yīng)該選擇1∶20、1∶30、1∶40三個水平。

圖1 藥脂比對包合率的影響Fig.1 Effect of lipid ratio on entrapment efficiency

2.1.2 膜材比對包埋率的影響

在藥脂比為1∶10，水化溫度為40 ℃，按照不同的膜材比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1進(jìn)行包埋，得到膜材比與包埋率的關(guān)系。如圖2所示，得出枸杞多糖脂質(zhì)體制備過程中包合率在膜材比4∶1為轉(zhuǎn)折點，所以膜材比應(yīng)該選擇3∶1、4∶1、5∶1三個水平。

圖2 膜材比對包合率的影響Fig.2 Effect of membrane ratio on entrapment efficiency

2.1.3 水化溫度對包埋率的影響

在膜材比為4∶1，藥脂比為1∶10，水化溫度為20、30、40、50、60、70 ℃時進(jìn)行包埋，得到水化溫度與包合率的關(guān)系。如圖3所示，得出枸杞多糖脂質(zhì)體制備過程中包合率在水化溫度40 ℃為轉(zhuǎn)折點，所以水化溫度應(yīng)該選擇30、40、50 ℃三個水平[18]。

圖3 水化溫度對包合率的影響Fig.3 Effect of temperature on entrapment efficiency

2.2 枸杞多糖脂質(zhì)體制備的響應(yīng)面實驗分析

2.2.1 響應(yīng)值結(jié)果及其擬合模型

采用Box-Behnken設(shè)計方案得到實驗設(shè)計及結(jié)果如表2所示。

應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化枸杞多糖脂質(zhì)體的制備工藝，以膜材比、藥脂比、水化溫度為單因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，可得到下列實驗結(jié)果，如表3所示。通過回歸方程分析可以得到3個因素與枸杞多糖脂質(zhì)體制備工藝的包合率之間的多元二次編碼回歸方程為：

Y=70.00+1.00A-1.38B+3.38C-0.25AB+1.75AC-1.00BC-3.75A2-5.50B2-6.00C2

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for the developed regression model

注：**表示差異極顯著(p<0.01)。

方差分析見表3，從回歸方程的一次項系數(shù)絕對值中可以得出以下結(jié)論：3個因素對包埋率的影響程度大小分別為C(水化溫度)>B(膜材比)>A(藥脂比)[18]。

二次項A2，B2，C2對于枸杞多糖脂質(zhì)體制備中的包合率的影響具有極顯著性。響應(yīng)面實驗結(jié)果得出最優(yōu)工藝是藥脂比為1∶32.15、膜材比為3.84∶1、水化溫度為43.26℃時，得到枸杞多糖脂質(zhì)體的包埋率理論上能達(dá)到70.766 9%。

2.2.2 等高線圖和響應(yīng)曲面圖分析

由圖4、圖5可知，隨著藥脂的比例增加包含率也在逐步上升，當(dāng)藥脂比達(dá)到1∶30左右時包含率達(dá)到最大值。可能為相同脂質(zhì)材料在相同條件下所形成的脂質(zhì)體膜和包合條件相同，隨著藥物濃度的增加，更多的藥物被包合在脂質(zhì)體膜中。但是當(dāng)濃度繼續(xù)增加時，包合多糖的能力達(dá)到飽和，而未包合的多糖分子增加，繼而包合率下降。

圖4 藥脂比、膜材比對包合率的影響Fig.4 Effect of lipid ratio and membrane ratio on entrapment efficiency

圖5 藥脂比、水化溫度對包合率的影響Fig.5 Effect of lipid ratio and temperature on entrapment efficiency

由圖4、圖6可知，當(dāng)其他條件一定時，膜材比與包合率的關(guān)系是隨著膜材比的變化包合率向增大后減小，膜材比在4∶1左右時包合率達(dá)到最大。大豆卵磷脂決定脂質(zhì)體的數(shù)量而膽固醇決定大豆卵磷脂的成膜性，故實驗中固定大豆卵磷脂用量，改變膽固醇用量[19]。6∶1的膜材比使只有少量的大豆卵磷脂成為脂質(zhì)體，隨著膽固醇量的增加更多的大豆卵磷脂形成脂質(zhì)體，4∶1左右包合率達(dá)到最大，但是隨著膽固醇接著增加脂質(zhì)體成膜性變差，包合率減小。

圖6 膜材比、水化溫度對包合率的影響Fig.6 Effect of membrane ratio and temperature on entrapment efficiency

由圖5、圖6可知，溫度對包合率的影響是隨著溫度升高包合率變大，直至40 ℃左右包合率達(dá)到最大，之后溫度增加包合率降低。包合是一種放熱過程，從低溫度到高溫度的過程的變化是先溫度升高使分子運動加劇，利于整個包合過程。但是40 ℃左右后溫度的增加使逆反應(yīng)增加，不利整個包合過程，包合率降低。

由響應(yīng)面圖可知藥脂比、膜材比和水化溫度對包合率均呈現(xiàn)不同的影響作用，或相互交叉性影響[18]。如膜材比和藥脂比之間，當(dāng)膜材比一定時，包合率隨著藥脂比的變化先增大后減小，當(dāng)藥脂比處于1∶30附近包合率較大；同樣當(dāng)藥脂比不變時，隨著膜材比的變化呈現(xiàn)出先增大在減小的趨勢，說明膜材比在4∶1附近最為合理。圖中顯示出坡面趨勢變化較大，說明膜材比與藥脂比之間交叉影響較大。

2.3 驗證試驗分析

把響應(yīng)面法分析得出的枸杞多糖脂質(zhì)體制備工藝的最佳工藝條件結(jié)合實際可操作條件，選取藥脂比1∶32，膜材比4∶1，水化溫度43 ℃條件下進(jìn)行3組平行試驗，所選條件比預(yù)測條件稍低，得出實際包埋率略低于預(yù)測值，相對誤差值0.95%。

2.4 掃描電鏡觀察結(jié)果

圖7給出了枸杞多糖表面和晶體結(jié)構(gòu)的電鏡照片， 圖7-A、圖7-B中掃描尺寸1 μm×1 μm，顯示卵磷脂或脂質(zhì)體沉積在枸杞多糖表面形成非晶體結(jié)構(gòu)。在圖7-C、圖7-D掃描尺寸2 μm×2 μm中可觀察到表面形成一些較為粗糙的類球形顆粒，部分可見雙分子膜結(jié)構(gòu)，屬于單室脂質(zhì)體[19-20]。

圖7 電鏡掃描結(jié)果枸杞多糖脂質(zhì)體(A,B)掃描尺寸2 μm×2 μm，枸杞多糖脂質(zhì)體(C,D) 掃描尺寸1 μm×1 μmFig.7 Scanning electron micrograph of lycium barbarum polysaccharide liposome

3 結(jié)論

脂質(zhì)體具有眾多輸送載體無法比擬的優(yōu)點，但在實際應(yīng)用中仍存在一定的局限，主要表現(xiàn)在脂質(zhì)體對酸、熱等敏感，在貯藏期間易聚集融合、絮凝，導(dǎo)致芯材泄漏[20-23]。因此，脂質(zhì)體作為功能因子輸送載體在應(yīng)用受到限制。如何在維持脂質(zhì)體載體系統(tǒng)自身優(yōu)勢的前提下，進(jìn)一步增強其對體內(nèi)、外環(huán)境的耐受性，對于拓寬脂質(zhì)體在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義[24-26]。

本實驗選用天然磷脂作為主要壁材，針對枸杞多糖構(gòu)建安全有效的脂質(zhì)體輸送體系，采用薄膜分散水化法進(jìn)行脂質(zhì)體的制備，為水溶性不穩(wěn)定天然藥物制備成脂質(zhì)體的可行性研究提供理論指導(dǎo)。運用響應(yīng)面設(shè)計構(gòu)建單因素和包合率數(shù)學(xué)模型。實驗中考察不同因素水平對枸杞多糖脂質(zhì)體的制備工藝。通過3因素3水平的響應(yīng)面實驗設(shè)計得出，枸杞多糖最佳脂質(zhì)體制備工藝為藥脂比1∶32.15、膜材比3.84∶1、水化溫度43.26 ℃時，得到枸杞多糖脂質(zhì)體的包合率理論上70.77%。相對誤差為0.95%。本研究對于以枸杞多糖為代表的親水性功能因子輸送載體的可控構(gòu)建具有一定的實踐意義。

[1] 張鳴號,王秀玉,王秀梅,等.枸杞多糖對小鼠移植性肝癌抑制作用的實驗研究[J].中草藥,2012,43(6):1 142-1 146.

[2] GUO Y, SHEN Li-xian, LU Yan-feng,et al.Preparation of rutin-liposome drug delivery systems and evaluation on their in vitro antioxidant activity[J].Chinese Herbal Medicines,2016(4):371-375.

[3] 高煥,高琪,王德云,等.淫羊藿多糖脂質(zhì)體制備條件的優(yōu)選[J].中藥材,2011,34(9):1 429-1 433.

[4] 劉曉明,畢華,高振強,等.猴頭菇多糖脂質(zhì)體包封率的測定方法及其穩(wěn)定性研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,10(24):118-121.

[5] 劉躍華.茯苓多糖脂質(zhì)體的制備[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2012,26(5):46-48.

[6] 郭璐玫,夏修吉,吳靜瀾,等.正交試驗優(yōu)選仙人掌多糖脂質(zhì)體的制備工藝研究[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,34(5):22-24.

[7] AL-JAMAL W T,KOSTARELOS K.Liposomes:From a clinically established drug delivery system to a nanoparticle platform for theranostic nanomedicine[J].Accounts of Chemical Research.2011, 44(10): 1 094-1 104.

[8] PAL'TSEV M A,KISELEV V I,SVESHNIKOV P G.Nanotechnology in medicine[J].Herald of the Russian Academy of Sciences.2009, 79(4): 369-377.

[9] RAHMAN Y-E,ROSENTHAL M W,CERNY E A.Intracellular plutonium:Removal by liposome-encapsulated chelating agent[J].Science.1973, 180(4083): 300-302.

[10] 李妍,陳旭,許暉.兩種山藥多糖含量提取試驗的結(jié)果分析[J].宿州學(xué)院學(xué)報,2015,30(1):92-95.

[11] 范云鵬,王德云,胡元亮,等.正交試驗優(yōu)選黃芪多糖脂質(zhì)體的制備工藝[J].中草藥,2011,42(3):470-473.

[12] 耿傳信,楊海,劉雪麗,等.灰樹花多糖脂質(zhì)體的制備方法研究[J].中國藥房,2011,21(39):3 687-3 689.

[13] 張忠山,王曉梅,劉重斌,等.滸苔多糖脂質(zhì)體的制備及其抗腫瘤活性研究[J].糧食與油脂,2016,29(10):82-84.

[14] 賀寅,王強,鐘葵,等.響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取龍眼多糖工藝研究[J].食品科學(xué),2011,32(2):79-83.

[15] 趙永新,趙子劍,王鄒,等.羧甲基茯苓多糖脂質(zhì)體的制備及其包合率的測定研究[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2013,10(3):130-132.

[16] 吳永軍.響應(yīng)面優(yōu)化水溶性萵苣多糖提取工藝[J].荊楚理工學(xué)院學(xué)報,2012,27(2):15-21.

[17] 鄭彬.銀杏葉提取物前體脂質(zhì)體的構(gòu)建、評價及其腸吸收機(jī)理的研究[D].長春:吉林大學(xué),2016:57.

[18] 耿敬章.響應(yīng)面優(yōu)化水酶法提取桂花油及其微膠囊化工藝研究[J].糧食與油脂,2015,28(9):27-30.

[19] 陳穎,黃海潮,朱慶玲,等.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化α-細(xì)辛腦脂質(zhì)體噴鼻劑的制備工藝[J].中國藥房,2014,24(5):431-434.

[20] 陳春燕,趙軍,陳蓓,等.激光散射法測定阿苯達(dá)唑脂質(zhì)體粒度的研究[J].中國藥房,2013,24(33):3 131-3 134.

[21] FAN Y, ZHANG Q.Development of liposomal formulations:From concept to clinical investigations[J].Asian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2013, 8(2): 81-87.

[22] LI Z, ZHANG Y, WURTZ W, et al.Characterization of nebulized liposomal amikacin (ArikaceTM) as a function of droplet size[J].Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery,2008,21(3): 245-254.

[24] YARMOLENKO P S,ZHAO Y,LANDON C, et al.Comparative effects of thermosensitive doxorubicin-containing liposomes and hyperthermia in human and murine tumours[J].International Journal of Hyperthermia, 2010, 26 (5): 485-498.

[25] BOVIER P A.Epaxal?: A virosomal vaccine to prevent hepatitis A infection[J].Expert Review Vaccines, 2008, 7(8):1 141-1 150.

[26] KANRA G,MARCHISIO P,FEITERNA-SPERLING C, et al.Comparison of immunegenicity and tolerability of a virosome-adjuvanted and a split influenza vaccine in children[J].The Pediatric Infectious Disease Journal, 2004, 23 (4): 300-306.