活細胞在線監控L-羥脯氨酸補料發酵工藝的研究

蔡萌萌，戶紅通，劉子強，徐慶陽,2,3，陳寧,2,3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(代謝控制發酵技術國家地方聯合工程實驗室，天津，300457)3(天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津，300457)

L-羥脯氨酸是膠原蛋白的主要組成成分，具有抗氧化、抗輻射、減肥、治療疾病等作用，在醫藥、生化、食品及美容業等方面具有廣泛應用。L-羥脯氨酸的生產方法有生物提取法、化學合成法和微生物發酵法。目前，國內生產L-羥脯氨酸的主要方法是生物提取法，但該方法存在純化步驟長，成本高，廢棄物污染嚴重等缺點[1]；化學合成法也因成本高昂而不適合工業生產[2]；微生物發酵法具有原料來源廣泛，反應所需能耗低，環境污染小等優點。

可靠的活細胞量是發酵過程中重要的參數之一，有代謝活力的細胞量與生產效率密切相關[3]。發酵過程中需要根據細胞數量來調節補料[4]，傳統的補料策略通常是根據發酵液的吸光度來調節，但吸光度反映的是發酵液中的細胞總量，包括死細胞和活細胞，同時它的數值會在一定程度上受培養基成分的影響，所以單純根據吸光度并不能對發酵過程進行準確的調控。活細胞在線檢測儀能夠實時監測發酵過程中的電容，只有具有完整細胞膜的細胞才能被極化形成電容，而細胞膜破裂的死細胞和發酵液中的培養基顆粒等不會形成電容，所以不會被檢測到[5]，且電容值和活細胞數量之間存在線性關系[6]，根據該數值調控L-羥脯氨酸發酵，能夠有效地控制發酵過程中副產物的形成，提高產品產量和糖酸轉化率。

本實驗在安裝有活細胞在線檢測儀的發酵罐中進行L-羥脯氨酸的發酵，發酵過程中根據電容值進行補料調節，通過對傳統補料發酵與活細胞在線監控補料發酵的代謝流量進行分析，確定活細胞在線監控補料技術對L-羥脯氨酸發酵的影響，為進一步提高L-羥脯氨酸產量，提高糖酸轉化率，減少副產物的形成奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

Escherichiacoli4HYP，由天津科技大學代謝工程研究室提供。

1.2 培養基

斜面培養基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.4 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，卡那霉素50 mg/L。

種子培養基：葡萄糖30 g/L，酵母粉6 g/L，檸檬酸0.5 g/L，(NH4)2SO41 g/L，KH2PO42 g/L，VB11 mg/L，VH0.3 mg/L，卡那霉素50 mg/L。

1.3 培養方法

1.3.1 菌種活化

在無菌條件下，取2環保菌管中的菌種接種于斜面培養基中，37 ℃恒溫靜置培養12 h，再將斜面菌種接種于250 mL茄形瓶中，37 ℃恒溫靜置培養12 h。

1.3.2 5 L罐種子培養

在無菌條件下，將適量無菌水倒入茄形瓶中，用接種環將菌體懸浮，然后采用火焰接種的方式將菌懸液接種于5 L種子罐培養基中進行培養。培養溫度為37 ℃，初始通氣量為2 L/min，初始攪拌轉速為200 r/min，通過自動流加25%的氨水控制培養基pH為7.0～7.2，當溶氧低于25%時，通過攪拌和通風控制溶氧在25%～30%，以泡敵消泡，每隔2 h測樣、記錄數據，當OD600值達到15左右時，準備接入發酵培養基。

1.3.3 30 L罐發酵培養

在小學語文教學中，通過閱讀教學可以培養學生的綜合能力，提高學生的語文素養，因此，教師要加強閱讀教學，使閱讀教學發揮重要的作用，確保學生閱讀學習的有效性，要提倡新課改的教學理念，創新教學方法，合理地運用多元化教學方式，使小學語文閱讀教學工作得到良好的進展，使其發揮重要的教學價值，下面對小學語文閱讀教學策略進行詳細的分析和探討。

按10%的接種量將種子液接種至裝有發酵培養基的30 L發酵罐中，培養溫度為37 ℃，通過自動流加25%的氨水控制培養基pH為7.0～7.2，通過攪拌和通風控制溶氧在25%～30%，當培養基中葡萄糖耗盡時，以一定的脈沖比流加80%的葡萄糖溶液，當溶氧無法達到25%時，保持最大轉速和通風繼續發酵，發酵過程中，以泡敵消泡，每隔2 h測樣、記錄數據。

1.4 分析方法

1.4.1 pH值測定

采用pH 6.4～8.0的精密pH試紙及發酵罐附帶的pH電極進行測定。

1.4.2 菌體濃度測定

見參考文獻[7]。

1.4.3L-羥脯氨酸含量測定

取適量發酵液于13 000 r/min離心2 min，獲得發酵上清液，取20 μL上清液加入1 mL 5%雙氧水溶液中，滴2滴1% CuSO4溶液，然后加入1 mL 10% NaOH溶液，搖勻后室溫反應10 min，直至淡黃色消失，不再產生氣泡，加入1 mL 1%對二甲氨基苯甲醛硫酸溶液，搖勻后沸水浴5 min，顏色由粉紅色變為暗紅色，冷卻后加入10 mL蒸餾水，搖勻后在560 nm處測吸光度，根據標準曲線求得L-羥脯氨酸濃度。其中標準曲線的繪制方法為：分別配制質量濃度為0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 g/L的L-羥脯氨酸標準溶液，按照上述方法進行測定，繪制標準曲線。

1.4.4 有機酸含量測定

采用高效液相色譜法檢測有機酸含量。色譜柱Aminex HPX-87H Column(300 mm×7.8 mm)；流動相5 mmol/L H2SO4；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；紫外檢測波長215 nm。

1.4.5 氨基酸副產物測定

采用Elite-AAA氨基酸分析儀進行測定。

1.4.6 活細胞在線檢測

使用來自ABER公司的活細胞在線檢測儀，將其連接在30 L發酵罐上，121 ℃、20 min原位滅菌，在接入種子液前進行清零處理，接種后進行計數處理，活細胞在線檢測儀即可將發酵液中的電容信號經過信號處理和軟件分析計算自動得出電容值。

1.4.7L-羥脯氨酸生物合成代謝流平衡模型的建立

見參考文獻[8-11]。

2 結果與分析

2.1 活細胞在線監控補料發酵對補糖速率的影響及最佳補糖策略的確定

常規補料發酵L-羥脯氨酸是根據OD600值調整補糖速率，活細胞在線監控補料發酵是根據活細胞在線檢測儀顯示的電容值進行補料調節，發酵過程中，OD600值和電容值的變化趨勢如圖1所示。

圖1 OD600值與電容Fig.1 OD600 and capacitance

由圖1可以看出，在菌體生長的遲緩期和對數期，OD600值和電容值的增長趨勢大致相同，當菌體生長達到穩定期之后，OD600依然表現出輕微增長的趨勢，而電容值則先呈穩定狀態，然后出現明顯下降的趨勢。這是因為穩定期時，菌體生長和死亡的數量處于動態平衡之中，吸光度只能反映出細菌總數，不能區分死、活細胞，所以OD600只能表現出菌體數緩慢增長的狀態，而活細胞在線檢測儀是檢測發酵液中活菌體形成的電容體系，細胞膜通透性發生變化的死菌體不會被檢測到，因此，電容值能及時反映出活菌數狀態[12]。穩定期之后，菌體生長進入衰亡期，菌體死亡數量大于生長數量，此時，電容值呈明顯下降趨勢，OD600值仍呈穩定狀態。

為了比較常規補料發酵和活細胞在線監控補料發酵的區別，確定活細胞在線監控補料發酵的最佳補糖策略，本實驗對補糖策略1、2、3、4和5進行了比較，其中，策略1是常規補料發酵，策略2、3、4和5是活細胞在線監控補料發酵，具體補糖速率如圖2所示。不同補糖策略對L-羥脯氨酸產量及乙酸積累量的影響如圖3所示。

圖2 活細胞在線監控發酵對補糖速率的影響Fig.2 Effect of online monitoring feed fermentation of living cells on sugar supplement rate

圖3 不同補糖策略對L-羥脯氨酸產量及乙酸積累量的影響Fig.3 Effect of different sugar supplement strategies on the L-hydroxyproline production and accumulation of acetic acid

由圖2可以看出，在菌體生長穩定期之前，常規補料和活細胞在線監控補料兩種補料方式的補糖速率基本相同，但穩定期之后，OD600值仍呈緩慢上升趨勢，而電容值能呈現出活菌數減少的趨勢。因此，采用常規補料發酵策略不能及時對補糖速率進行調整，而活細胞在線監控補料能夠在發酵中后期及時降低補糖速率，從而減少副產物的形成，降低生產成本。由圖3可知，隨著中后期補糖速率的降低，發酵液中乙酸積累量逐漸減少，同時也降低了對菌體的抑制作用，產量得以提高，但以策略5(發酵中后期及時降低補糖速率，最終降到8.5 g/(L·h))進行補糖時，可能是由于補糖量不能滿足菌體需要，最終導致產量較低，所以，確定策略4(發酵中后期及時降低補糖速率，最終降到9 g/(L·h))為最佳的補糖策略，此時，L-羥脯氨酸產量最高，達42.03 g/L，乙酸積累量為2.75 g/L，比常規發酵降低了48.69%。

2.2 活細胞在線監控補料發酵對L-羥脯氨酸產量的影響

采用活細胞在線監控補料發酵對L-羥脯氨酸產量的影響如圖4所示。

圖4 活細胞在線監控補料發酵對L-羥脯氨酸產量的影響Fig.4 Effect of online monitoring feed fermentation of living cells on L-hydroxyproline production

采用活細胞在線監控補料發酵，在發酵前24 h，L-羥脯氨酸產量和常規補料發酵的產量大致相同，這是因為發酵22 h之前，兩種補料發酵方式的控制條件相同，補糖速率也基本一致，但22 h之后，監控發酵及時調整補糖速率，將補糖速率降低，有效地抑制了副產物的形成，而常規發酵卻沒有及時對補糖速率進行調整，導致副產物積累，對菌體產生抑制作用，24 h之后，監控發酵的產量明顯超過常規發酵的產量，最終，發酵32 h，活細胞在線監控補料發酵L-羥脯氨酸的產量達到42.03 g/L，較常規補料發酵的37.73 g/L提高了11.39%。

2.3 活細胞在線監控補料發酵對糖酸轉化率的影響

在工業生產過程中，較高的糖酸轉化率可以給企業帶來更高的經濟效益，采用活細胞在線監控補料發酵對L-羥脯氨酸糖酸轉化率的影響如圖5所示。

由圖5可以看出，在發酵22 h之前，常規補料發酵與活細胞在線監控補料發酵L-羥脯氨酸的糖酸轉化率基本一致，但22 h之后，活細胞在線監控補料發酵降低補糖速率，常規發酵卻未及時做出調整，導致副產物積累，對菌體產生抑制作用，所以，監控發酵的糖酸轉化率明顯超過常規發酵的糖酸轉化率，最終達19.79%，較常規補料發酵提高了14.92%。所以，活細胞在線監控補料發酵可以在一定程度上提高葡萄糖轉變為L-羥脯氨酸的效率，對降低L-羥脯氨酸生產成本，提高工廠效益有重要的意義。

圖5 活細胞在線監控補料發酵對糖酸轉化率的影響Fig.5 Effect of online monitoring feed fermentation of living cells on glucose conversion rate

2.4 活細胞在線監控補料發酵對L-羥脯氨酸代謝流的影響

基于L-羥脯氨酸代謝網絡，得到化學計量平衡式和代謝節點處反應速率方程，分別見表1和表2。

根據發酵過程中菌體的生長情況，假設22～28 h這一階段細胞處于擬穩態，測定此時間段葡萄糖、丙氨酸、乳酸、乙酸、賴氨酸和L-羥脯氨酸的胞外濃度，分別計算其積累或消耗速率，再利用MATLAB軟件計算L-羥脯氨酸生物合成途徑的代謝流分布情況，得到的結果如圖6和圖7所示。

表1 化學計量平衡式Table 1 Stoichiometric equation

表2 代謝節點處反應速率方程Table 2 Reaction rate equation of metabolic nodes

圖6 常規補料發酵時L-羥脯氨酸合成代謝流分布Fig.6 Metabolic flux distribution of L-hydroxyproline without online monitoring feed fermentation of living cells

圖7 活細胞在線監控補料發酵時L-羥脯氨酸合成代謝流分布Fig.7 Metabolic flux distribution of L-hydroxyproline with online monitoring feed fermentation of living cells

6-磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate, G6P)、丙酮酸(pyruvic acid, Pyr)和異檸檬酸(isocitric acid, ICI)是L-羥脯氨酸生物合成代謝途徑的關鍵節點。G6P決定著流向糖酵解途徑(glycolytic pathway, EMP)和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, HMP)的流量分布，HMP途徑能夠為L-羥脯氨酸合成中心代謝途徑的關鍵反應提供還原力，使更多的代謝流流向L-羥脯氨酸；Pyr是EMP途徑進入三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle, TCA)的入口，當EMP途徑的代謝流量超過TCA循環的代謝能力時，會使代謝流流向副產物，造成副產物的積累；ICI的合成需要CO2固定反應和乙醛酸循環提供草酰乙酸(oxalacetic acid, OAA)，而ICI又是L-羥脯氨酸合成的前體物，同時也是TCA循環轉向乙醛酸循環的入口代謝物，所以ICI對調節TCA循環和乙醛酸循環之間的流量分配具有重要作用。由圖7可知，常規發酵進入EMP途徑和HMP途徑的代謝流分別為63.40、36.60，生成乙酸的代謝流為5.83，從ICI進入乙醛酸循環和TCA循環的代謝流分別為4.44、151.58，L-羥脯氨酸合成的代謝流為23.20，而活細胞在線監控補料發酵進入EMP途徑的的代謝流為58.01，進入HMP途徑的代謝流為41.99，生成乙酸的代謝流為5.54，從ICI進入乙醛酸循環和TCA循環的代謝流分別為3.69、147.43，L-羥脯氨酸合成的代謝流為26.96。所以，采用活細胞在線監控補料發酵，EMP途徑和乙醛酸循環的代謝流分別減少了8.50%、16.89%，HMP途徑的代謝流增加了14.73%，乙酸合成的代謝流減少了4.97%，L-羥脯氨酸合成的代謝流提高了16.21%。

3 結論

本研究利用活細胞在線監控技術調節L-羥脯氨酸補料發酵，能夠在發酵中后期根據活細胞量及時調整補糖策略，確定了活細胞在線監控補料發酵的最佳補糖策略，避免了因補糖過多導致的副產物大量積累，或補糖過少導致的L-羥脯氨酸產量下降等問題，提高了葡萄糖利用率，降低了生產成本。采用活細胞在線監控補料發酵，在發酵中后期及時降低補糖速率，最終降到9 g/(L·h)時最佳，最終，L-羥脯氨酸產量提高了11.39%，乙酸積累量減少了48.69%，糖酸轉化率提高了14.92%，EMP途徑和乙醛酸循環的代謝流分別減少了8.50%、16.89%，HMP途徑的代謝流增加了14.73%，乙酸合成的代謝流減少了4.97%，L-羥脯氨酸合成的代謝流提高了16.21%。

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