熒光定量PCR檢測在人巨細胞病毒-IgM陰性嬰兒巨細胞病毒感染診斷中的意義

謝利波， 劉敏， 王敏

我國是人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染的高發區，HCMV一旦侵入人體，將長期或終身存在于體內，在大多數免疫正常個體表現為無癥狀感染，但對于胎兒和嬰兒卻可出現明顯癥狀[1]。HCMV感染的靶器官與宿主年齡密切相關，先天性宮內感染的胎兒會導致中樞神經系統損害和各種先天畸形等可能導致死亡的嚴重損害[2-3]。嬰幼兒感染以肝炎、肺炎多見，較大兒童感染則多無癥狀[4]。由于HCMV感染缺少典型的臨床癥狀，但其感染對于嬰兒危害比較大，僅靠臨床表現不能明確診斷，診斷HCMV感染主要依賴于實驗室證據，包括病毒學檢查或血清學檢查結果的支持[4-5]。大部分醫院目前沒有開展基于病毒學原理的病毒分離培養方法診斷HCMV感染，而運用經典的酶聯免疫吸附實驗檢測HCMV-IgM抗體的檢出率低，特別是對于新生兒和幼小嬰兒由于其產生IgM的能力弱，即使IgM陰性也不能排除HCMV感染的可能[4]。國內外研究顯示，由于病毒DNA的出現通常早于病毒感染的臨床癥狀或血清學反應，熒光定量PCR技術目前已成為了一種能早期、敏感地發現HCMV感染存在的診斷方法[6-7]。本研究通過分析嬰兒HCMV-IgM抗體陰性情況下聯合定量檢測嬰兒尿液及其母親乳汁HCMV-DNA的熒光定量結果來探討其在對嬰兒HCMV感染診斷中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月至2015年12月宜昌市中心人民醫院兒科收治疑似HCMV感染患兒304例，其中男150例，女154例；年齡2 d至12個月，平均(99.3±44.8)d。根據患兒主訴及體格檢查、臨床第一診斷將疑似HCMV感染患兒分為肝炎組186例、肺炎組71例及其他組(主訴為發熱、腹瀉等)47例。肝炎組中男100例，女86例；年齡2 d至4個月，平均(73.0±55.6)d。肺炎組中男31例，女40例；年齡30 d至7個月，平均(113.0±48.7) d。其他組中男19例，女28例；年齡50 d至12個月，平均(98.0±58.9) d。3組患兒在性別、年齡方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入標準 (1)患兒為母乳喂養；(2)年齡為1歲以內；(3)巨細胞病毒抗體IgM的血清學檢測結果為陰性。

1.3 排除標準 患兒近1個月已使用抗巨細胞病毒藥物如阿昔洛韋、更昔洛韋等。

1.4 方法

1.4.1 標本采集 初診的第2天上午用無菌試管分別留取嬰兒尿液及其母親的母乳及時送檢，不能及時送檢的暫時儲存于4 ℃冰箱中。

1.4.2 檢測方法 所用7300型熒光定量PCR儀(美國ABI)，試劑購自中山大學達安基因股份有限公司。熒光定量PCR檢測HCMV-DNA按試劑說明書操作，乳汁及尿液離心后用生理鹽水洗滌沉淀，12 000 r/min離心5 min后去上清，往沉淀中加DNA提取液50 μL混勻后置于100 ℃金屬浴10 min，12 000 r/min離心5 min后取5 μL做模板進行定量PCR擴增。

1.4.3 結果判斷 HCMV-DNA的標準曲線呈典型的S曲線且標本定量結果>500拷貝/mL為陽性，否則為陰性。所有實驗數據在陰、陽對照均在控的情況下獲得。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理，計數資料采用χ2檢驗，多組計數資料兩兩比較采用bonferroni法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同疾病組HCMV-DNA檢出率比較 見表1。

表1 3組患兒尿液及母乳HCMV-DNA檢出率比較[n(%)]

表1結果表明，肝炎組和其他組尿液HCMV-DNA檢出率顯著低于母乳，差異有統計學意義(P<0.05)。肺炎組尿液HCMV-DNA檢出率與母乳比較差異無統計學意義(P>0.05)。3組間尿液和母乳中HCMV-DNA檢出率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 不同年齡患兒尿液及母乳HCMV-DNA檢出率比較 見表2。

表2 不同年齡患兒尿液及母乳HCMV-DNA檢出率比較[n(%)]

表2結果表明，年齡<90 d患兒尿液HCMV-DNA檢出率顯著低于年齡90～180 d和>180 d患兒，差異有統計學意義(P<0.05)；年齡90～180 d和>180 d患兒尿液HCMV-DNA檢出率比較差異無統計學意義(P>0.05)；不同年齡患兒乳汁HCMV-DNA檢出率比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.3 不同標本類型檢出陽性率 見表3。檢出尿液與乳汁同時陽性88例(28.95%)，乳汁陽性174例(57.24%)，尿液陽性141例(46.38%)。

表3 乳汁/尿液HCMV-DNA檢測陰、陽性例數(n)

3 討論

HCMV感染性很強，致病性卻不是很強，易被宿主抑制而不對機體造成嚴重的持久損害。由于嬰兒免疫功能不完善，阻止HCMV入侵的能力較弱，故極易受感染。嬰兒感染后多數可能有不同程度的肝膽受損[4]，少數嬰兒感染后會發生間質性肺炎。本研究也提示，感染巨細胞病毒患兒中肝炎組例數最多且其平均年齡最小，同時尿液及母乳雙陽性中有50%出自肝炎組，提示肝臟可能是嬰兒期極易受到巨細胞病毒感染的器官。

我國溫州地區的一項研究結果顯示，該地區住院患兒HCMV-IgG陽性率達83%，而1歲以內患兒HCMV-IgG陽性率僅64.1%，且<28 d患兒IgM陽性率僅1%[8]，主要由于嬰兒免疫力低，產生IgM的能力較弱，故假陰性多。目前熒光定量PCR技術已經成為一種獲得公認的快速、高特異性和靈敏度的臨床輔助診斷技術[9-12]。熒光定量PCR技術通過檢測巨細胞病毒DNA載量，使其成為了一種能早期、敏感地發現巨細胞病毒感染存在的診斷方法[13]，特別在HCMV-IgM陰性的情況下尤其試用。由于巨細胞病毒任何年齡小兒體內HCMV活動復制時，都會在腎臟進行，產生病毒尿癥，卻無明顯的泌尿系統感染表現[5]。處于活動性HCMV感染期的母親乳汁是嬰兒后天感染HCMV的一個重要途徑。由于尿液及乳汁取材方便容易，可重復檢測用于療效監測，成為臨床常用的檢測標本。

既往研究多集中在早期、多種方法聯合檢測巨細胞病毒感染，而此文設定在特定的情況下，即高度懷疑巨細胞病毒感染但無確切巨細胞病毒現癥感染的證據(HCMV-IgM陰性)時，聯合尿液及乳汁行巨細胞病毒DNA檢測。此研究發現，尿液檢出陽性率為46.38%，略高于韓劍英等[14]報道的41.74%，考慮一方面可能與現今市場上熒光定量PCR檢測產品的不斷技術改良有關，另外一方面也可能與病例納入標準不完全一致有關。

翁玉英等[15]對不同標本進行HCMV-DNA檢測，發現嬰兒尿液及乳汁陽性率均顯著高于淋巴細胞，且母乳陽性率與尿液及淋巴細胞陽性率、HCMV-IgM陽性率均顯著正相關，提出聯合檢測有助于輔助診斷。沈丹等[16]對3種標本進行HCMV-DNA檢測，提出3次混合尿標本檢出率最高，朱艷萍等[17]和Choudhary等[18]則提出進行尿液HCMV-DNA聯合血清HCMV-IgM檢測以提高陽性率。由此可見，尿液及乳汁的HCMV-DNA檢測越來越受到廣大兒科醫生的關注。此研究結果也顯示患兒母乳中HCMV-DNA陽性率均高于50%以上，提示母乳是重要的潛在傳染源，對于先天、后天免疫功能低下或用免疫抑制劑的患兒，有必要預防感染。本研究總共有304例患兒，由于新生兒不足10例，未單獨統計。對于高度懷疑而血清CMV-IgM檢測結果為陰性的，最好能同時檢測HCMV-DNA及抗HCMV抗體，提高檢出率。既往認為HCMV-DNA陽性只能表示感染卻不能區分產毒感染或潛伏感染[4-5]，但近期隨著研究的深入和完善，有研究表明高HCMV-DNA載量提示活動性HCMV感染[11]，更多研究者提出了聯合檢測及肯定了尿液HCMV-DNA檢測對于嬰幼兒巨細胞病毒感染的診斷價值[14-18]。但不能證明與臨床感染疾病有直接關系，結合臨床，只能推測。

此研究中304例患兒母乳與尿液HCMV-DNA雙陽性88例，雙陰性77例，雙陰性中有54例來自平均年齡最小的嬰兒肝炎綜合征組，且后續復查結果證實有尿液HCMV-DNA陽性或CMV-IgM陽性，說明尿HCMV-DNA載量明顯增高可以用作活動性病毒感染的指標。年齡較小的患兒的感染主要來自母親，且由于嬰兒免疫力不完善和HCMV排毒具有間歇性的特點，容易漏檢，對于高度懷疑患兒可考慮需隔段時間復查HCMV-DNA和CMV-IgM或按照沈丹等[16]的方法取3次混合尿標本進行檢測。

[1] Angelova M, Kovachev E, Todorov N. Cytomegalovirus Infection during Pregnancy and Its Impact on the Intrauterine Fetal Development-Case Report[J]. Open Access Maced J Med Sci，2016，4(3):449-452.

[2] Turner KM, Lee HC, Boppana SB, et al. Incidence and impact of CMV infection in very low birth weight infants[J]. Pediatrics，2014，133(3):e609-615.

[3] 張琳,王淮燕.新生兒先天性巨細胞病毒感染的研究進展[J].現代預防醫學,2013,40(16):3031-3033.

[4] 祝軻，王江濤.小嬰兒巨細胞病毒感染臨床診治分析[J].中國中西醫結合兒科學，2017,9(1)：52-54.

[5] 唐華.人巨細胞病毒感染的實驗室診斷技術研究進展[J].現代醫藥衛生, 2015,31(3):383-386.

[6] Kawano Y, Kawada J, Kamiya Y, et al. Analysis of circulating human and viral microRNAs in patients with congenital cytomegalovirus infection[J]. J Perinatol，2016，36(12)：1101-1105.

[7] Liu Z, Zhang P, Tang S, et al. Urine real-time polymerase chain reaction detection for children virus pneumonia with acute human cytomegalovirus infection[J]. BMC Infect Dis，2014，14:245.

[8] Zhang Q, Gao Y, Peng Y, et al. Epidemiological survey of human cytomegalovirus antibody levels in children from Southeastern China[J]. Virol J，2014，11:123.

[9] 彭芬，沈昌桃，吳華莉，等.新生兒巨細胞病毒感染的臨床特征分析[J].中華醫院感染學雜志，2015，25(18):4257-4259.

[10]Dioverti MV, Razonable RR. Cytomegalovirus[J]. Microbiol Spectr，2016，4(4) :2025.

[11]張玲，張清祿.不同保存時間對血漿標本中人巨細胞病毒載量的影響[J].檢驗醫學與臨床，2015，12(20):3078-3079.

[12]施保華,汪海霞,范澤旭,等.實驗室診斷嬰幼兒感染人巨細胞病毒的方法學比較[J].廣東醫學，2014，35(20):3218-3220.

[13]李佳凌，巫岳龍，鄒禮樂等.血液中檢測人巨細胞病毒的熒光定量PCR方法建立及評估[J].中國輸血雜志，2015，28(6)：637-641.

[14]韓劍英，劉歡歡，杜芳芳.熒光定量PCR技術在診斷嬰兒人巨細胞病毒感染中的應用[J].基礎醫學論壇，2014，18(20)：2657-2659.

[15]翁玉英，倪琛，林秀鳳，等.不同標本巨細胞病毒檢測在診斷小兒人巨細胞病毒感染中的應用[J].分子診斷與治療雜志，2014，6(6)：410-414.

[16]沈丹,黃少軍,汪晶晶.三種標本CMV-DNA含量檢測在兒童巨細胞病毒性肝炎診斷和治療監測中的應用[J].肝臟,2015,20(1):35-37.

[17]朱艷萍,于珍,布月青,陳欣欣,楊巧芝.尿液CMV-DNA聯合血清CMV-IgM檢測對嬰幼兒巨細胞病毒感染的診斷價值[J].中國婦幼保健,2015,30(18):2960-2962.

[18]Choudhary A, Pati SK, Patro RK, et al. Comparison of conventional, immunological and molecular techniques for the diagnosis of symptomatic congenital human cytomegalovirus infection in neonates and infants[J]. Indian J Med Microbiol，2015，33 Suppl:15-19.