川崎病患兒治療前后外周血單核細胞P22phox表達的變化及其臨床意義

鄧斌， 黃宇， 趙凌， 皮光環

川崎病是一種病因不明，以全身彌漫性血管炎為主要病變的急性發熱出疹性疾病[1]。病理學證實，單核/巨噬細胞在川崎病急性期滲入冠狀動脈壁內外的炎癥細胞中占主導地位，受炎性細胞因子激活而進一步遷移、浸潤，并引起一系列反應，包括活性氧的產生[2]。研究發現，氧化應激在伴有冠脈瘤的川崎病患者中增加，并且與動脈內膜中層增厚和硬化相關[3]。P22phox作為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶重要的亞單位，與其激活密切相關。P22phox活性的改變可影響體內活性氧的產生，在氧化應激所致的炎癥中起著重要作用[4]。本研究采用RT-PCR技術初步觀察川崎病患兒治療前后和正常兒童外周血單核細胞中P22phox的變化及其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年10月至2016年6月川北醫學院附屬醫院兒科收治住院的川崎病患兒40例，其中男24例，女16例；年齡0.5～6.5歲，平均年齡(2.75±1.04)歲；有冠脈損害者15例，無冠脈損害者25例。同期選擇本院小兒外科擇期手術患兒20例為正常組，其中男13例，女7例；年齡1.2～8.5歲，平均年齡(3.48±1.42)歲。兩組患兒在性別、年齡方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標準 參照2009年中華醫學會兒科學分會制定的川崎病診斷標準[5]。川崎病合并冠狀動脈病變的超聲診斷標準為[6]：(1)冠狀動脈擴張的診斷標準：<3歲>2.5 mm，3～9歲>3 mm，>9～14歲>3.5 mm。(2)冠狀動脈瘤的診斷標準：冠狀動脈擴張內徑大于正常1.5倍。小冠脈瘤：局部冠脈擴張內徑<4 mm。中等冠脈瘤：冠脈管腔內徑4～8 mm，或≥5歲兒童，冠脈管腔內徑介于正常冠脈內徑的1.5～4倍。巨大冠脈瘤：冠脈管腔內徑>8 mm，或≥5歲兒童冠脈管腔內徑大于正常冠脈內徑的4倍。

1.3 川崎病的治療 (1)人免疫球蛋白治療：于起病發熱的第7天，使用國際推薦人免疫球蛋白單次劑量2 g/kg，10～12 h內靜脈輸入。(2)阿司匹林口服：采用日本推薦中等劑量即30～50 mg/(kg·d)，分2～3次，熱退3 d后逐漸減量，14 d后減至3～5 mg/(kg·d)，1個月后復查血常規、肝功、血沉、C反應蛋白及超聲心動圖，無異常者于發病后8～12周停藥，有冠脈病變者，需服用至冠狀動脈內徑恢復正常。

1.4 標本收集 分別收集川崎病患兒入院當天(發熱4～5 d，人免疫球蛋白治療前)、人免疫球蛋白治療3 d后和非感染對照組兒童靜脈血3 mL，置肝素抗凝管，2 000 r/min×10 min離心，吸取上層血漿置于-80 ℃冰箱凍存備檢。剩余加入等體積無菌磷酸鹽緩沖液，混勻后用淋巴細胞分離液(購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)密度梯度離心后分離外周血單核細胞。

1.5 外周血單核細胞中P22phox mRNA表達的檢測 采用TRIzol(天根生化科技有限公司)一步提取外周血單核細胞中的RNA，應用紫外分光光度儀(GENEQUANT,UK)測定細胞總RNA的濃度和純度。

1.6 反轉錄合成cDNA 參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書(TaKaRa公司，日本)，將10 μL已經去除基因組的反應液也加入10 μL反轉率反應液中，總反應體系為20 μL，42 ℃ 15 min合成cDNA，作為PCR 反應的模板，于-20 ℃保存。

1.7 實時熒光定量PCR反應 使用SYBR Premix Ex Tap Ⅱ熒光染料和熒光定量PCR儀進行擴增。P22phox引物及內參序列由上海生物工程有限公司設計并合成。P22phox引物序列：上游：5′-CGA GCG GCA TCT ACC TAC TG-3′；下游：5′-GCT TGA TGG TGC CTC CGA T-3′；產物長度為99 bp。內參GAPDH序列：上游：5′-CTG GGC TAC ACT GAG CAC C-3′；下游：5′-AAG TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3′；產物長度101 bp。反應體系為SYBR Premix Ex Tap Ⅱ 10 μL；P22phox引物各0.5 μL；GAPDH各0.5 μL；ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 6.6 μL；總計20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。

1.8 擴增曲線 所有基因在循環數內達到平臺期，說明擴增良好；融解曲線:單峰說明產物特異性好。

2 結果

2.1 定量結果 P22phox及GAPDH基因擴增曲線起峰良好，基線穩定。溶解曲線均呈單峰，無雜峰，說明無非特異性擴增產物產生，定量結果符合實驗要求，見圖1(封三)。

2.2 川崎病患兒外周血單核細胞P22phox mRNA表達分析 川崎病組治療前后P22phox mRNA的表達比較差異有統計學意義(P<0.05)；川崎病組治療前與正常組P22phox mRNA的表達比較差異有統計學意義(P<0.01)；川崎病組治療后與正常組P22phox mRNA的表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 川崎病組治療前后及正常組P22phox mRNA表達的比較

注：與治療前比較，at=2.510，P<0.05；與正常組比較，bt=5.058，P<0.01。

2.3 治療前CALs、NCALs，治療前后CALs，治療后CALs、NCALs，治療前后NCALs各組P22phox mRNA表達分析 治療前CALs、NCALs P22phox mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；治療前后CALs P22phox mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；治療后CALs與NCALs P22phox mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)；治療前后NCALs P22phox mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2(封三)。

3 討論

研究表明，氧化應激參與川崎病急性期血管炎的發生，血管內皮功能障礙及氧化應激與后期的冠狀動脈粥樣硬化密切相關[7]。細胞色素b245(P22phox)是一種廣泛存在的蛋白質，由位于染色體16q24上的CYBA基因編碼。作為煙酰胺脫氫酶/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的一個亞單位，P22phox在傳遞電子及產生超氧陰離子方面起重要作用。其表達增加時NADPH氧化酶活性增加，進而增加體內活性氧水平，導致氧化還原信號改變，引起一系列功能紊亂。研究顯示，氧化應激過程中產生的活性氧會損傷DNA，引起血管內皮細胞損傷，導致血管功能障礙[8]。以往研究顯示，血管內皮損傷、血管彈力蛋白與血管壁結構蛋白酶的降解、負向調節T細胞活化可能與川崎病患兒冠脈損傷發生機制相關。成纖維細胞生長因子23、中性粒細胞表面黏附分子、白細胞介素1β、腫瘤壞死因子α等因子異常表達，核因子κB途徑等細胞內信號傳導通路的異常均可導致血管內皮的免疫性損傷。

本研究結果表明，川崎病急性期治療前外周血單核細胞P22phox mRNA表達顯著高于治療后及正常組的表達，而治療后與正常組表達無差異，治療前有冠脈損害和無冠脈損害P22phox mRNA表達無差異，表明急性期外周血單核細胞P22phox mRNA存在高表達情況，提示氧化應激可能參與川崎病急性期的發病機制。阿司匹林及人免疫球蛋白治療可使外周血單核細胞P22phox mRNA表達降低。川崎病急性期P22phox mRNA表達升高的機制目前尚不明確，國外學者研究表明核因子κB、白細胞介素1β均可上調P22phox的表達[9-10]，Yin等[11]研究發現川崎病患兒外周血單核細胞核因子κB活性顯著升高，是否急性期外周血單核細胞P22phox mRNA的高表達與核因子κB活性升高有關，亦或核因子κB是通過上調P22phox的表達而導致血管內皮的免疫性損傷有待更進一步的研究。研究顯示，阿司匹林可抑制環氧合酶1、環氧合酶2，進而抑制血小板活化和炎癥反應，可通過減輕氧化性低密度脂蛋白介導的損傷及增加內皮細胞鐵蛋白表達而起抗氧化作用，可通過調節一氧化氮合成來改善血管舒縮活性，可通過抑制核因子κB的活化而在轉錄水平調控多種促炎因子的表達[12]。人免疫球蛋白能夠封閉單核/巨噬細胞壁上的FC受體，下調核因子κB活性，抑制單核細胞產生細胞因子。因此推測阿司匹林及人免疫球蛋白可能是通過下調核因子κB活性導致P22phox下調，進一步抑制活性氧的產生，是否阿司匹林及人免疫球蛋白還可通過影響其他P22phox調節因素來下調P22phox mRNA的表達有待進一步研究。

值得關注的是，雖然整體上治療前外周血單核細胞P22phox mRNA表達高于治療后，但我們也發現40例川崎病患兒(15例冠脈損害，25例正常)中有9例患兒(4例冠脈損害，5例正常)的P22phox mRNA表達治療后高于治療前。眾所周知，阿司匹林及人免疫球蛋白治療后仍有少許患兒并發冠脈損害，國外研究顯示有川崎病病史的成年冠脈粥樣硬化患者存在全身性血管內皮細胞功能障礙及氧化應激，認為血管內皮細胞功能障礙及氧化應激是川崎病患者冠脈粥樣硬化早期發病的危險因素之一[7]。P22phox編碼基因CYBA具有多態性，研究發現C242T、A640G、A930G基因多態性與氧化應激所導致的心血管疾病相關[13-15]，是否本實驗中出現的治療后P22phox mRNA表達升高是實驗誤差還是上述情況的可能機制有待于樣本量的進一步擴大以及對恢復期患兒的隨訪研究。

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