風味酶控結合乳化修飾技術制備多肽脫苦豆乳(粉)工藝

吳長玲，王冬梅，魏冬旭，譚 越，王中江，李 楊，江連洲，范志軍

(1黑龍江省北大荒綠色健康食品有限責任公司，黑龍江佳木斯 154002；2 東北農業大學食品學院，哈爾濱 150030)

苦味一直是蛋白水解過程困擾著食品界的瓶頸問題，并阻礙了其在功能性豆乳粉加工工業中的應用[1-2]。T.K.Murry等[3]研究發現，牛奶蛋白水解產生苦味而明膠和蛋清蛋白水解無苦味，并測定活性炭吸附物質具有較多的多肽組分，初步證明苦味是由特定多肽序列產生的，而不是游離氨基酸產生的。目前，已有研究報道采用連續密閉蒸煮技術應用于稻谷熟化加工、高溫滅菌及濃縮，然而將該技術協同風味修飾應用到豆乳(粉)加工中的研究尚未見報道。本文以傳統濕法制備豆乳粉為基礎，采用連續密閉蒸煮濃縮、麥芽糊精/β-環糊精乳化及風味蛋白酶低限制性酶解風味修飾處理技術制備多肽脫苦強化型豆乳(粉)，研究風味修飾聯控技術制備工藝對豆乳(粉)中多肽得率、苦味值的影響，并確定最佳加工工藝，得到高營養型多肽強化豆乳(粉)，并對豆乳(粉)的分子量、多肽含量、異黃酮含量及口感進行分析，為多肽強化型豆乳(粉)的生產加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆，哈爾濱九三油脂集團；風味蛋白酶Flavourzyme 500 MG(500 LAPU/g)，諾維信；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；蛋白標準液，上海升正公司；考馬斯亮藍(R-250)、大豆卵磷脂，華美生物工程有限公司；麥芽糊精(食品級，DE20)，山東西王食品有限公司；β-環糊精，上?；瘜W試劑采購供應站，純度98%；基礎試劑均為分析純。

1.2 儀器

ZCG500立式法蘭蓋電加熱蒸煮罐，上?？苿跈C械設備有限公司；FDM-Z80豆漿機，上海偉業儀器廠；Ultra-Turrax T25高速分散器，德國IKA公司；噴霧干燥機，無錫昂益達機；AL204型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；酶標儀SH-1000，日本Corona electric公司；垂直板電泳儀，北京六一儀器公司；Tanon 凝膠成像系統，上海天能公司；XW-80A旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；高速離心機，德國 Eppendorf 公司；THZ-80水浴鍋，江蘇電子有限公司；HYP-Ⅱ八孔消化爐，上海纖檢儀器有限公司；LNK-871型凱氏定氮快速自動蒸餾器，江蘇省宜興市科教儀器研究所；D-6L超高壓均質機，美國PhD科技有限公司。

1.3 豆乳(粉)的制備方法

1.3.1 工藝流程 精選大豆→清洗→磨漿→過濾→連續密閉蒸煮→冷卻→風味蛋白酶酶解→滅酶→高壓均質→滅菌→氣流噴霧干燥→多肽強化豆乳(粉)。

1.3.2 豆乳(粉)制備方法及關鍵技術要點 根據齊寶坤等[4]的制作方法進行修改，精選并稱量50 g優質黃豆，浸泡10 h(0.5%的NaHCO3溶液)，熱燙5 min(沸水)，用分離式磨漿機將大豆磨成漿體磨漿(豆水比1∶7，pH 6.5～7.0，溫度90℃)，漿液經120目篩過濾去除豆渣，對豆乳進行連續密閉蒸煮處理，經連續密閉蒸煮處理后的豆乳溫度和pH進行調節，堿性蛋白酶 Protex6L(8 900U/mL)酶解，風味蛋白酶酶解，酶解結束后，95℃溫度下滅酶5 min，混入2%的乳化劑大豆磷脂，真空濃縮(濃縮至固形物含量為15%左右即可)，經高壓微射流均質處理后，噴霧干燥(進口溫度185℃、出口溫度85℃)即得豆乳粉樣品。對照組不進行連續密閉蒸煮及復合酶解風味修飾處理。

1.4 風味蛋白酶低添加限制性控位酶解工藝

保持連續密閉蒸煮處理壓強300 MPa、連續密閉蒸煮溫度120 ℃、蒸煮時間20 min、酶解溫度55℃、風味蛋白酶酶解pH 7.0，選取麥芽糊精與β-環糊精添加量比值為2∶1、麥芽糊精與β-環糊精總添加量為15%。分別選取風味蛋白酶添加量0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，酶解時間為5、10、15、20、25 min，進行單因素試驗。通過多肽得率(%)及苦味值分析確定高壓均質處理工藝單因素最優條件。

1.5 麥芽糊精/β-環糊精乳化劑風味修飾試驗

保持連續密閉蒸煮處理壓強為300 MPa、連續密閉蒸煮時間20 min、連續密閉蒸煮溫度120 ℃，并保持酶解溫度55℃、風味蛋白酶酶解pH 7.0，選取風味蛋白酶添加量0.4%，酶解時間15 min，同時，在其他條件不變的情況下，選取麥芽糊精與β-環糊精添加量比值為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1及麥芽糊精與β-環糊精總添加量為5%、10%、15%、20%、25%進行單因素試驗。通過豆乳(粉)中多肽得率(%)及苦味值比較分析確定酶解工藝單因素最優條件。

1.6 連續密閉蒸煮聯合復合酶解—風味修飾工藝的響應面優化試驗

以豆乳(粉)中多肽得率(%)及苦味值為考察指標，通過單因素試驗考察風味蛋白酶添加量、酶解時間、麥芽糊精與β-環糊精添加量比值及麥芽糊精與β-環糊精總添加量對各指標的影響規律。進一步利用Design-Expert軟件對試驗進行響應面分析設計優化試驗結果，選取風味蛋白酶添加量A(%)、酶解時間B(min)、麥芽糊精與β-環糊精添加量比值C、麥芽糊精與β-環糊精總添加量D(%)等4個因素為自變量，以豆乳(粉)中多肽得率(%)及苦味值分別為響應值R1、R2，設置4因素5水平進行試驗(表1)。

1.7 豆乳(粉)中大豆分離蛋白的提取

根據Petruccelli等[5]的方法。

1.8 多肽含量的測定

表1 因素水平編碼

根據王常青等[6]方法進行改進，總氮采用半微量凱氏定氮法測定；多肽得率按照水解后離心上清液中總氮量與黑豆奶中總氮量的比值進行計算，如式(1)：

(1)

1.9 乳化活性(EA)和乳化穩定指數(ESI)測定

乳化性能的測定參照Tang[7]和周瑩等[8]的方法，取一定體積濃度為 0.5 %的蛋白質溶液，加入同體積的葵花籽油，以10 000 r/min 的速度高速攪拌1 min，之后分別在0、10 min 取樣，以 0.1 % (w/v)SDS (十二烷基磺酸鈉，pH 7.0)稀釋 100 倍，以SDS溶液為空白，測定 500 nm 處的吸光度值，以 0 min 的吸光度值(A0)表示EA，乳化穩定性用 ESI 表示，如式(2)：

(2)

式(2)中：A0：0時刻的吸光值；ΔT：時間差 (min)；ΔA：ΔT 內的吸光值差。

1.10 起泡性測定

根據曲曉婷等[9]對米糠蛋白乳化性測定方法，取50 mL 3 %(w/v)豆粉懸浮液用高速分散器以10 000 r/min的速度攪打2 min，用10 mL 蒸餾水清洗刀具，洗液小心并入起泡液中，記錄攪打前后的體積。起泡能力用體積增加的百分比表示。隨后，將攪打起泡的樣品分別靜置20、40、60、120 min，記錄不同時間段的泡沫體積。同樣條件下攪打2%、4%、5%、7%和10%(w/v)豆粉懸浮液，記錄泡沫體積變化。

(3)

式(3)中：FC：起泡能力(%)；FS：起泡穩定性(%)；V1：攪打前的體積mL)；V2：攪打后的(mL)；V3：放置一段時間后的泡沫體積(mL)。

1.11 水解度測定

大豆蛋白水解度參照趙新淮等[10]和D.Spellman等[11]的方法進行測定。

1.12 溶解性的測定

溶解性用蛋白質分散指數表示。參照齊寶坤等[4]的方法，取5 g豆乳粉樣品溶于100 mL去離子水中，攪拌30 min使豆粉充分溶解，靜置分層后進行離心(3 000 r/min、10 min)，利用凱氏定氮法測定離心后的上清液蛋白含量。按式(4)計算蛋白質分散指數(溶解性)：

(4)

1.13 SDS-PAGE凝膠電泳

參考Laemmli[12]的方法。

1.14 苦味值測定

根據周志紅等[13]研究方法改進進行苦味值測定。

1.15 數據處理

每組試驗都進行3次平行試驗，并將試驗數據進行誤差分析。采用統計學軟件SPSS 18對試驗數據進行方差分析、相關性和差異顯著性分析；采用Origin 8.5軟件進行作圖；數據及方差分析利用響應面分析的Design-Expert軟件進行。

2 結果與分析

2.1 風味蛋白酶低添加限制性控位酶解工藝單因素試驗

2.1.1 風味蛋白酶添加量對豆乳(粉)多肽得率及苦味值的影響 選取麥芽糊精與β-環糊精添加量比值為2.5∶1、麥芽糊精與β-環糊精總添加量為16%及酶解時間18 min。選取風味蛋白酶添加量0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%等5個水平進行單因素試驗。以豆乳(粉)中多肽含量(%)及苦味值為指標分別進行實驗，每個水平重復3次。根據圖1所示，其他條件不變情況下，隨著風味蛋白酶添加量的不斷增加，豆乳(粉)中多肽含量呈上升趨勢，其中，添加量在0%～0.4%范圍內增加幅度較為明顯，當風味蛋白酶添加量超過0.4%時，豆乳(粉)中多肽含量增加緩慢，甚至出現降低現象。

圖1 風味蛋白酶添加量對豆乳(粉)多肽得率及苦味值的影響

2.1.2 酶解時間對豆乳(粉)多肽得率及苦味值的影響 選取酶解時間5、10、15、20、25 min等5個水平進行單因素試驗。以豆乳(粉)中多肽含量(%)及苦味值為指標分別進行實驗，每個水平重復3次。由圖2發現，在豆乳(粉)加工過程中，其他條件不變，不斷延長風味蛋白酶的酶解時間可有效提高豆乳中的多肽含量，并顯著降低蛋白酶酶解過程中產生的苦味口感，當風味蛋白酶酶解時間達到18min后，豆乳體系這種向“好”的趨勢變化不明顯。以上現象說明，在一定程度上控制風味蛋白酶的酶解時間可有效提高豆乳(粉)中的多肽含量，并降低苦味口感，從而提高豆乳粉品質特性，增強其營養價值。綜上所述，本研究設定最佳風味蛋白酶酶解時間為18 min。

圖2 酶解時間對豆乳(粉)多肽得率及苦味值的影響

2.2 麥芽糊精/β-環糊精乳化劑風味修飾單因素試驗

2.2.1 麥芽糊精與β-環糊精添加量比值對豆乳(粉)多肽得率及苦味值的影響 選取麥芽糊精與β-環糊精添加量比值為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1等5個水平進行單因素試驗，以豆乳(粉)中多肽含量(%)及苦味值為指標分別進行實驗，每個水平重復3次。

根據圖3所示，在其他條件不變情況下，隨著麥芽糊精添加比例的不斷增加，豆乳多肽得率呈現先升高后降低的變化趨勢，當麥芽糊精與β-環糊精添加量比值在2∶1左右時，多肽得率達到最大。隨著麥芽糊精添加量的增加，豆乳在酶解過程中產生的苦味口感改善越來越明顯，這可能是由于麥芽糊精能在疏水基團及油脂表面形成膜，有效減少苦味肽與疏水作用基團的結合，降低顆粒的表觀黏度，從而隔絕苦味肽與外界的接觸，另一方面可能因為麥芽糊精本身就為一種低吸水性材料，添加適量麥芽糊精能有效改善豆粉體系的持水性[14-16]。根據相關研究，羥基與淀粉分子結合的作用大于與水分子的結合，顯示低的持水力，反之則顯示高的持水力。本研究設定麥芽糊精與β-環糊精添加量比值為2.5∶1。

圖3 麥芽糊精與β-環糊精添加量比值對豆乳(粉)多肽得率及苦味值的影響

2.2.2 麥芽糊精與β-環糊精總添加量對豆乳(粉)多肽得率及苦味值的影響 選取風味蛋白酶添加量0.5%、酶解時間18 min及麥芽糊精與β-環糊精添加量比值為2.5∶1，同時，在其他條件不變的情況下，選取麥芽糊精與β-環糊精總添加量為5%、10%、15%、20%、25%等5個水平進行單因素試驗，以豆乳(粉)中多肽含量(%)及苦味值為指標分別進行實驗，每個水平重復3次。根據圖4所示，在其他條件不變情況下，隨著麥芽糊精與β-環糊精總添加量的不斷增加，豆乳體系多肽得率及苦味值均呈下降趨勢，豆粉苦味值隨麥芽糊精與β-環糊精總添加量的不斷增加變化越來越明顯，說明添加一定量的麥芽糊精與β-環糊精能夠顯著改善豆粉苦味口感，同時說明麥芽糊精、β-環糊精與風味蛋白酶酶解對豆乳(粉)的風味修飾有顯著協同作用，具體機理有待進一步研究。

圖4 麥芽糊精與β-環糊精總添加量對豆乳(粉)多肽得率及苦味值的影響

2.3 具有高多肽得率脫苦多肽強化型豆乳(粉)連續密閉蒸煮聯合復合酶解—風味修飾工藝的響應面優化試驗

利用統計軟件Design-Expert進行響應曲面法過程優化，以風味蛋白酶添加量A(%)、酶解時間B(min)、麥芽糊精與β-環糊精添加量比值C、麥芽糊精與β-環糊精總添加量D(%)4個因素為自變量，以豆乳(粉)中多肽得率(%)及苦味值分別為響應值R1、R2(表2)。

表2 試驗安排及結果

R1=9.96-0.75A+0.47B+0.35C-0.19D+0.057AB+0.23AC+0.28AD-0.043BC-0.17BD-0.53CD-0.46A2-0.73B2-0.81C2-0.57D2

(5)

表3 回歸與方差分析結果

為適應生產，將制備條件優化為風味蛋白酶添加量0.5%、酶解時間為15 min、麥芽糊精與β-環糊精添加量比值為2∶1、麥芽糊精與β-環糊精總添加量為15%，此條件下多肽得率有最優值為10.01%，說明響應值的實驗值與回歸方程預測值吻合良好。由感官評價的結果可知，此條件下得到的豆乳(粉)沒有苦味，為多肽強化型豆乳(粉)的加工推廣提供科學依據。

豆乳(粉)中多肽得率R2通過Design-Expert軟件對數據進行分析，得到二次回歸模型如式(6)：

R2=0.27+0.22A-0.058B-0.13C-0.28D-0.19AB-0.057AC+0.054AD-0.037BC+0.039BD-0.069CD+0.34A2+0.33B2+0.19C2+0.36D2

(6)

表4 回歸與方差分析結果

2.4 不同加工工藝制備豆乳(粉)乳化性分析

根據圖7所示，通過對比發現，經風味蛋白酶修飾酶解、麥芽糊精與β-環糊精乳化修飾及二者結合改性處理豆乳工藝制備的豆乳(粉)，其乳化性及乳化穩定性均呈增加趨勢，此時，多肽含得率增加，豆乳苦味值下降，且與單獨風味酶修飾處理及單獨麥芽糊精與β-環糊精乳化修飾制備的豆乳(粉)相比，二者結合的風味修飾工藝制備的豆乳(粉)乳化性及乳化穩定性效果最佳，多肽得率較高，此條件下豆乳體系基本無苦味。

圖7 不同加工工藝制備的豆乳(粉)理化特性分析

3 結論

本研究應用響應面優化最佳多肽強化型脫苦豆乳(粉)制備工藝，由響應面分析結果表明，在風味蛋白酶添加量0.5%、限制性酶解時間為18 min、麥芽糊精與β-環糊精添加量比值為2.5∶1、麥芽糊精與β-環糊精總添加量為16%的條件下，多肽得率達到最高為10.21%，并消除豆乳苦味，且溶解性達到86%、 異黃酮含量達到180mg/g、多肽含量超過10%?！?/p>

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