肝蘇顆粒對膽總管阻塞性肝纖維化大鼠肝功能和病理損傷的影響

謝君，謝曉芳，李夢婷，唐欣，熊秋韻，彭成

膽總管結扎手術是制備阻塞性肝纖維化動物模型的方法[1]。肝蘇顆粒是由趕黃草制成的單味中成藥制劑，有研究表明趕黃草提取物可減輕膽汁淤積性肝纖維化[2]，本課題組前期發現肝蘇顆粒對CCL4導致的化學損傷性肝纖維化有治療作用[3]，現為探尋肝蘇顆粒對膽總管結扎致阻塞性肝纖維化疾病的預防及治療作用，為肝蘇顆粒的進一步臨床應用提供藥理理論依據，故本實驗通過結扎大鼠膽總管建立阻塞性肝纖維化模型，觀察肝蘇顆粒對實驗性肝纖維化的防治作用及探討初步作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SD大鼠，體重180～220 g，雄性，SPF級，由四川省中醫藥科學院實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(川)2013-19。已通過實驗動物倫理委員會批準使用。

1.2 藥物與試劑

受試藥物：肝蘇顆粒浸膏，提供單位：四川古藺肝蘇藥業有限公司，5 g原生藥/mL，實驗前用蒸餾水分別配制成1.67 g·mL-1備用；秋水仙堿片，由云南植物藥業有限公司生產，批號20141103，使用前用生理鹽水配成0.01 mg·mL-1備用；水合氯醛，由成都市科龍化工試劑廠提供，批號20111123；ALT、AST試劑盒均購自中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為150681、150611；TBIL、ALP、ALB、TP試劑盒均由四川邁克生物科技股份有限公司提供，批號1115121、0315071、1215061、1115031。

1.3 主要儀器

全自動生化分析儀（美國BECKMAN COULTER公司，型號AU5400）；低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號TDZ5-WS）；多功能酶標儀（美國Thermo公司，VARIOSKAN FLASH）。電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司，型號JA1003。

2 方法

2.1 造模及給藥

通過文獻報道[1]及預試驗確定造模方法。取成年SPF級別SD雄性大，64只大鼠，待適應環境后，按體重隨機分為4組，即假手術組、模型對照組、秋水仙堿組和肝蘇顆粒組，每組15只，禁食不禁水12 h后進行膽管結扎手術，具體方法：以10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉，仰臥位固定，去腹部被毛后用碘伏、酒精消毒皮膚，在劍突下約2 cm處沿腹正中線切開皮膚約3 cm，逐層打開腹腔，在十二指腸和胃大彎處的大網膜內找到膽總管，小心游離一段，將一鈍性針置于膽總管下，雙線結扎膽總管，然后逐層縫合腹膜、肌層和皮膚。假手術組暴露膽總管后即關腹，不行結扎。術后注射青霉素20萬U/只抗感染。實驗過程中室內溫度維持在25 ℃左右。于術后第2天開始灌胃給藥，假手術組和模型對照組給予生理鹽水10 mL/（kg·d）-1，肝蘇顆粒組灌胃藥液16.7 g·kg-1，秋水仙堿組灌胃秋水仙堿0.1 mg·kg-1。每日1次。當肝組織出現明顯肝纖維化表現時終止試驗，總時間不超過8周。

2.2 指標檢測及方法

末次給藥后，禁食不禁水12 h，然后以10%水合氯醛3 mL·kg-1腹腔注射麻醉，各組動物股動脈取血，約取3 mL于未加抗凝劑的采血管中。取血后，處死各組大鼠，每只大鼠剖取肝、脾、胸腺，稱濕重，計算臟器系數（臟器系數=臟器濕重/體重×100%），取血離心后取血清采用全自動生化儀測定ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和ALB水平，在同一肝葉位置切取小塊肝組織置入10%甲醛緩沖液固定，HE染色和Masson染色行病理組織學檢查。

2.3 統計學方法

所有數據均使用SPSS22.0軟件包建立數據庫，計量資料以均數±標準差形式（ x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗。

3 結果

3.1 一般情況

除假手術組外，膽總管結扎大鼠于手術后1周內開始出現黃疸，表現為眼睛、耳朵、皮毛黃染，尿液顏色呈濃茶色。2周后，各給藥組黃疸癥狀減輕，活動和進食情況均較模型對照組好。解剖時發現模型對照組大鼠膽管結扎膽管管徑增粗，肝腫大，或區域變硬，點狀壞死；給藥組大鼠上述病變相對模型對照組輕。從體重看，自第2周起，模型對照組大鼠體重明顯低于假手術組（P＜0.05或P＜0.01），而第4周起秋水仙堿組和肝蘇顆粒組大鼠體重均明顯高于模型對照組（P＜0.05或P＜0.01）。結果見下表1。

表1 肝蘇顆粒對膽管阻塞性肝纖維化大鼠體重的影響(x±s)

3.2 對膽管阻塞性肝纖維化大鼠肝功能的影響

根據模型對照組大鼠肝功能的變化在第8周末結束試驗。與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和球蛋白水平明顯升高，ALB含量及白球比值均明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對照組比較，秋水仙堿組和肝蘇顆粒組各給藥組血清ALT、AST、TBIL、ALP、DBIL及球蛋白含量均明顯下降（P＜0.05或P＜0.01），ALB含量及白球比值有增加。結果見下表2。

表2 肝蘇顆粒對膽總管結扎致肝纖維化大鼠肝功能的影響(x±s)

3.3 對膽管阻塞性肝纖維化大鼠肝，脾和胸腺臟器系數的影響

結果顯示，與正常對照組比較，模型對照組大鼠的肝臟系數均顯著升高（P＜0.01）；與模型對照組比較，陽性藥物組及肝蘇顆粒組可明顯降低肝臟系數，同時陽性藥物組可降低脾臟系數，肝蘇顆粒及秋水仙堿組對胸腺系數無明顯作用。結果見表3。

表3 肝蘇顆粒對膽總管結扎致肝纖維化大鼠臟器系數的影響(x±s)

3.4 對膽管阻塞性肝纖維化大鼠肝組織形態學的影響

HE染色結果顯微鏡下見假手術組肝臟形態結構正常，間質未見結締組織增生，無肝纖維化表現；模型對照組肝臟可見膽管上皮細胞增生，炎癥細胞浸潤，可見少量肝細胞壞死灶和大量脂肪空泡，膽管上皮周圍膠原纖維沉積，形成纖維間隔，分隔改建原有肝小葉，出現輕至中度的纖維化，秋水仙堿組及肝蘇顆粒組肝臟纖維化程度與模型對照組比較病變有所減輕。結果見下圖1。

Masson染色發現，正常對照組大鼠肝小葉結構清晰，細胞排列整齊，僅中央靜脈及匯管區血管壁著藍色，周圍有少量膠原纖維。模型對照組大鼠肝組織可見明顯的膽汁淤積，匯管區明顯著色，膠原纖維大量增生，纖維間隔增多增寬，并向肝小葉內延伸，交聯呈網狀結構，形成完整的纖維間隔，分隔改建后形成假小葉。秋水仙堿組大鼠肝匯管區增生纖維較模型對照組纖細菲薄，細胞少見腫脹和壞死，未見完整假小葉形成，肝竇周圍少量著色。肝蘇顆粒組大鼠肝組織僅見少量殘留的膠原纖維痕跡和膽汁淤積，病變分布小灶性，病變均明顯輕于模型對照組。見圖2。

圖2 肝蘇顆粒對膽總管結扎致肝纖維化大鼠肝組形態學的影響（Masson染色，100×；A．假手術組；B．模型對照組；C．秋水仙堿組；D．肝蘇顆粒組）

與正常對照組比較，模型對照組評分明顯升高，差異有顯著性意義(P＜0.01)。與模型對照組比較，各給藥組評分都降低，秋水仙堿組及肝蘇顆粒組可顯著降低肝纖維化評分（P＜0.05或P＜0.01）。結果見下表4。

表4 肝蘇顆粒對膽總管結扎致肝纖維化大鼠肝臟纖維化變的影響(x±s)

4 討論

膽總管結扎致阻塞性肝纖維化模型與臨床上因膽汁分泌障礙，膽道阻塞所引起的肝纖維化病程相似[4]，因此該模型可以應用在抗肝纖維化藥物篩選方面。通常將血清ALT與AST作為評判肝損傷程度的重要指標[5]，同時有研究表明AST水平與肝纖維化進展有相關性-[7]。TBIL和DBIL可作為膽汁淤積型肝損傷的檢查指標[8]。當膽汁排泄受阻時，血清ALP常與血清膽紅素相平行呈明顯升高趨勢[9]。ALB水平可以反映肝臟合成代謝和儲備功能，可以作為評估肝纖維化嚴重程度及判斷預后的指標[4]。

本實驗通過血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP等來判斷肝損傷的程度，再結合HE染色、Masson染色從不同的角度來反映肝蘇顆粒對肝纖維化的作用。從本研究結果來看，與假手術組比較，模型對照組大鼠血中ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平顯著升高，ALB水平明顯降低，差異具有顯著性（P＜0.01或P＜0.05），提示該模型大鼠的膽道梗阻明顯，肝細胞功能受到損傷。與模型對照組比較，肝蘇顆粒組大鼠血清ALB有所升高，其余指標均明顯降低，差異具有統計學意義（P＜0.01），表明肝蘇顆粒能降低膽總管結扎致肝纖維化大鼠肝損傷程度，降低膽紅素的作用。HE染色和Masson染色病理結果顯示，肝蘇顆粒可降低肝臟內炎癥反應和纖維化程度。

綜上所述，肝蘇顆粒能明顯改善膽總管結扎致肝纖維化大鼠的肝功能和肝組織病理損傷，具有顯著療效。而本藥的治療機制和量效關系有待進一步研究。

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