一種苯并咪唑酮類GSK-3抑制劑的純度研究

陳換飛，鄒靜，白蘭，賈貴清，彭婷，陳婷，吳小愚，張梅

目前，腫瘤作為影響人類健康的世界性難題，一直是醫(yī)藥領域研究的熱點和難點。新型安全、高效、副作用小的抗腫瘤藥物的研發(fā)則顯得意義重大。糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是一種多功能的絲氨酸蘇氨酸類蛋白激酶，當其在體內(nèi)異常表達時，引發(fā)糖尿病、阿爾茲海默癥以及直腸癌、胃癌等多種癌癥[1,2]。因此，GSK-3已成為抗腫瘤作用研究的熱門靶點，其相應的小分子抑制劑研究是抗腫瘤藥物研究的熱點。

Dibromophakellstatin是從Phakellia mauritiana分離的一種天然產(chǎn)物，其作為新型的抗腫瘤抑制劑，具有苯并咪唑-2-酮支架[3]。近年來相關研究也表明，具有苯并咪唑-2-酮結構的活性化合物，可以作為酯酶抑制劑、抗菌劑等[4-5]。其中如halopemide、UV0155069等作用于不同的腫瘤靶點時均有顯著抗腫瘤活性[6-11]。因此，二氫苯并咪唑-2-酮被用作抗腫瘤藥物研究領域的新型支架，受到越來越多的關注。

本實驗根據(jù)二氫苯并咪唑-2-酮類化合物潛在的抗腫瘤活性，綜合分析目前已報道的具有良好抗腫瘤作用的GSK-3小分子抑制劑如SB216763[12]、Azakenpaulllone[13]、compound 6h[14]的結構（IC50及結構見圖1），發(fā)現(xiàn)GSK-3抑制劑大多具有酰胺或內(nèi)酰胺結構。且鑒于磺酰胺基團常作為重要藥效基團出現(xiàn)在抗腫瘤藥物中，本課題組在前期實驗中，通過在5位引入磺酰胺基團，設計和合成了一系列新型GSK-3抑制劑—苯并[d]咪唑-2（3H）-酮衍生物（化合物5a-o）。相關體外抗腫瘤活性實驗表明，化合物5a-o對人乳腺癌細胞HCC1937、MDA-MB-468、人非小細胞肺癌細胞A549三種不同組織來源的腫瘤細胞具有不同程度的增殖抑制作用，其中化合物5b（結構見圖1）在這三種腫瘤細胞中均具有良好的抗腫瘤活性，其IC50分別為2.6 μM，3.1 μM，6.3 μM。因此建立一種簡便可行的純度分析測定方法，對于GSK-3小分子抑制劑化合物的合成、純度測定以及后續(xù)的相關開發(fā)研究具有重要意義。

圖1 部分文獻報道的GSK-3抑制劑（a,b,c）及化合物5b結構

本實驗依據(jù)相關參考文獻[15,16]，采用高效液相色譜法，對化合物5b的純度進行監(jiān)測，指導其化學合成。其合成路線如圖2所示。

圖2 苯并[d]咪唑-2（3H）-酮衍生物（化合物5a-o）的合成路線

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（e2695, 美國waters公司）；PDA檢測器（2998, 美國waters公司）；超聲清洗儀（KQ-2200, 昆山超聲儀器）；電子天平（JA1003，上海順宇恒平科學儀器）；實驗室純水系統(tǒng)（KMUPT-8/15/20, Millipore）。

1.2 試劑

化合物5b屬于本實驗室自行合成的新型抗腫瘤藥物，無市售對照品。化合物5b對照品由本實驗室前期合成，采用高效液相色譜面積歸一化法對化合物5b的純度進行檢測。根據(jù)面積歸一化法，計算得化合物5b的相對含量為98.14%，符合對照品的含量要求（大于98%）。 色譜甲醇，購自阿拉丁試劑公司；超純水由實驗室純水系統(tǒng)制備。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 Phenomenex Gemini C18110A色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇∶水（75∶25）；流速1 mL·min-1；柱溫為30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量為20 μL。

1.3.2 樣品的制備

1.3.2.1對照品溶液的制備 取化合物5b對照品10 mg，精密稱定，加入色譜甲醇溶解，定容至10 mL，精密量取1 mL該對照品溶液，稀釋至0.1 mg·mL-1，0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液用于HPLC進樣分析。

1.3.2.2 供試品溶液的制備 取化合物5b供試品1 mg，精密稱定，加入色譜甲醇溶解，定容至10 mL，精密量取1 mL該對照品溶液，稀釋至0.1 mg·mL-1，0.45 μm微孔濾膜過濾后，取續(xù)濾液用于HPLC進樣分析。

1.3.3 方法學考察

1.3.3.1 標準曲線的制備 精密吸取化合物5b對照品溶液稀釋成濃度分別為100、80、60、40、20 μg·mL-1的對照品溶液，按照上述色譜條件分別進樣分析,并記錄相應峰面積，以化合物5b的檢測濃度為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y進行線性回歸分析。

1.3.3.2 精密度試驗 精密吸取同一對照品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積。

1.3.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0，4，8，12，16，20，24 h時依照上述方法進樣測定。

1.3.3.4 重復性試驗 精密稱取同一批樣品，分別依法制備6份供試品溶液并測定含量。

1.3.3.5 加樣回收試驗 稱取6份同一批已知含量為981 mg·g-1的樣品1.020 mg，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入1 mg·mL-1化合物5b對照品溶液 0.8，1.0，1.2 mL，依“1.3.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.3.1”色譜條件進行測定，并計算回收率。

2 結果

2.1 方法學考察結果

線性回歸考察結果如圖3所示，回歸方程為Y=3.53×107X+52087，r=0.9999（n=5），結果表明，化合物5b在20～100 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好。

圖3 化合物5b標準曲線

精密度試驗，峰面積的平均值為5374093，RSD為0.63%（n=6），結果表明方法精密度良好；穩(wěn)定性試驗結果，峰面積的平均值為5369442，RSD為0.94%（n=7），表明供試品溶液在24h內(nèi)保持穩(wěn)定，符合測量要求；重復性試驗結果如表1所示，化合物5b平均含量為847 mg·g-1，RSD為0.52%（n=6），方法重復性良好；加樣回收試驗結果如表2所示，化合物5b平均回收率為100.44 %，RSD為0.78 %（n=6）。

表1 重復性實驗結果（n=6）

表2 化合物5b加樣回收試驗結果（n=6）

1.0 1.0 2.012 101.22 1.0 1.0 2.005 100.47 100.44 0.78 1.0 1.2 2.205 100.38 1.0 1.2 2.195 99.62

2.2 樣品測定結果

取三批合成所得產(chǎn)品，依法測定，測得化合物5b的含量分別為984 mg·g-1、990 mg·g-1、981 mg·g-1，計算結果顯示，所合成的化合物5b純度達98%以上，純度較高。高效液相色譜圖見圖4。

圖4 化合物5b HPLC圖（A.對照品 B.供試品）

3 討論

HPLC是基于經(jīng)典液相色譜法而迅速發(fā)展起來的可以快速高效分析樣品的方法。本實驗從化合物5b的物理性質以及實驗室現(xiàn)有儀器設備條件和可操作性等方面考慮，選擇了可操作性強、分析速度快、精度高的高效液相色譜法來對化合物5b的純度進行測定，并對測定方法進行了考察。

根據(jù)GSK-3抑制劑—苯并咪唑酮衍生物的合成路線，我們推測可能在b,c及d反應過程中，由于硝基為間位定位基，而氨基為鄰對位定位基，因此反應中除了在間位生成主產(chǎn)物化合物5b外，也可能會生成鄰位的副產(chǎn)物，且磺酰氯自身也會發(fā)生相應副反應。另外，在整個反應過程中，由于步驟較多，也會在反應及后處理過程中引入其他雜質。因此，為了獲得結構正確，純度合格的化合物5b，作者首先對化合物5b結構進行1H-NMR，13C-NMR鑒定，在1H-NMR圖譜中發(fā)現(xiàn)帶磺酸基的苯環(huán)上3個氫，其中有一個是單峰（s），另外兩個成雙重峰(d)，并沒有發(fā)現(xiàn)這三個氫的其他裂峰情況，表明該化合物就是目標化合物5b，并沒有生成鄰位的副產(chǎn)物。同時13C-NMR結果亦顯示化合物5b結構正確。其次，將化合物5b對照品進行全波長掃描，掃描結果顯示其在254 nm處有最大吸收，靈敏度最高且其余物質對化合物5b的吸收影響最小，因此選擇254 nm為測定波長。試驗中分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸水等不同流動相體系，考察結果表明采用甲醇-水體積比為75∶25作為流動相時，柱效較高且具有較好的分離度，故選擇甲醇-水（75∶25）作為化合物5b純度測定的流動相體系。本試驗亦對該分析方法的專屬性進行了考察，原料對化合物5b的測定無干擾且繪制的標準曲線的相關系數(shù)可以達到0.9999，表明此化合物20～100 μg·mL-1在線性關系良好。加樣回收率能夠反映分析方法在確定分析條件下樣本濃度測定的準確性，一般樣品的回收率宜在85%～115%的范圍內(nèi)，本試驗的平均加樣回收率達到100.44 %，RSD為0.78 %，表明該分析方法測定結果具有較高準確度。另外，精密度試驗中的RSD值為0.63 %，說明實驗方法具有良好的精密度。

綜上所述，HPLC測定化合物5b的純度，具有操作簡便，準確度高，分離度好等特點，符合HPLC的測定要求，可以用于監(jiān)測的化學合成反應進程和檢測GSK-3抑制劑苯并咪唑酮系列衍生物的純度。

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