效應面法優化地榆皂苷提取工藝

王玉，劉懷偉，張帥杰

地榆在我國廣泛分布，主產于東北、西北及華北地區，性微寒、味苦，歸肝、大腸經，功能涼血補血、解毒斂瘡[1]。現代研究發現其主要含有皂苷類、鞣質類等化學成分[2-3]，據藥理研究發現地榆皂苷類成分具有促造血細胞增殖、抗腫瘤、護膚養顏等作用，且地榆皂苷促造血細胞增殖作用較強，單獨作用能促使2種巨核祖細胞增殖和分化[4-8]。經文獻查閱，地榆皂苷提取工藝的研究較少，主要研究其成分和藥理作用，本實驗采用效應面法優化地榆皂苷提取工藝。效應面法是一種優化工藝條件的有效方法，已廣泛用于優化中藥有效成分提取工藝，主要通過非線性模型多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的關系，結果準確度高、可預測性強[9-11]。本研究首次采用效應面法優化乙醇直接提取地榆皂苷，為進一步開發地榆制劑奠定基礎。

1 儀器與材料

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Alltech2000型蒸發光散射檢測器（Agilent公司）；BT125D型分析天平（Sartorius公司）；地榆皂苷-Ⅰ對照品（批號111952-201301，中國食品藥品檢定研究院）；地榆皂苷-Ⅱ對照品（純度＞98%，批號:D-023-161108，購自成都瑞芬思生物科技有限公司）；地榆藥材（四川科倫藥業股份有限公司），按《中國藥典》2015年版一部地榆項下規定檢測，均符合要求。甲醇、乙腈為色譜純，所用水為純凈水，本文中所涉及的其他試劑均為分析純（成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 地榆皂苷-Ⅰ含量測定

2.1.1 對照品溶液配制 取地榆皂苷-Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含3 mg的溶液，即得（濃度3.011 mg·mL-1）。

2.1.2 供試品溶液制備 精密移取各實驗項下的提取液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.1.3 色譜條件及專屬性考察 安捷倫C18色譜柱（4.6×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（30:70）；檢測波長為208 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1；進樣量10 μL；分別取對照品溶液、空白溶劑、供試品溶液，按上述色譜條件進行試驗，HPLC圖如下圖1。峰型良好，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 地榆皂苷-Ⅰ色譜圖（對照品溶液、空白溶劑、供試品溶液）

2.1.4 標準曲線制備 分別精密移取不同濃度對照品溶液（0.3011，0.6022，0.9033，1.2044，1.5055，3.0110 mg·mL-1），按2.1.3項下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積Y為縱坐標，對照品濃度X為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=288.01X+1.1715(r =0.999 4)，表明地榆皂苷-Ⅰ在0.3011～3.0110 mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.1.5 精密度試驗 取地榆皂苷-Ⅰ對照品溶液、地榆供試品溶液分別重復進樣6次，按2.1.3色譜條件，測得地榆皂苷-Ⅰ峰面積的RSD為0.33%，地榆供試品溶液地榆皂苷-Ⅰ峰面積的RSD為0.85%。表明在該色譜條件下儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 精密移取2.1.2項下供試品溶液6份，按2.1.3色譜條件測定，RSD=0.93%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩定性試驗 精密移取2.1.2項下供試品溶液6份，按2.1.3色譜條件分別在0、2、4、12、24、48 h測定，RSD=0.69%，表明該供試品溶液在48 h內穩定。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取己知含量的地榆藥材粉末9份，每份約0.1 g，分別精密加入高、中、低含量的地榆皂苷-Ⅰ對照品溶液，每個含量平行測定3份，按2.1.2項下供試品溶液制備，按照2.1.3項下色譜條件進行測定，結果地榆皂苷-Ⅰ的平均加樣同收率為99.4%，RSD為1.44%。表明該方法準確度良好，見表1。

表1 HPLC法測定地榆皂苷-Ⅰ加樣回收率結果

2.2 地榆皂苷-Ⅱ含量測定

2.2.1 對照品溶液的配制 取地榆皂苷-Ⅱ對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，即得（濃度1.008 mg·mL-1）。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密移取各實驗項下的提取液10 mL，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 HPLC-ELSD色譜條件及專屬性考察 流動相為甲醇-水(70:30)，流速：1.0 mL·min-1；蒸發光散射檢測器；漂移溫度：100 ℃，氣體流速：3.0 L·min-1。進樣量10 μL；分別取對照品溶液、空白溶劑、供試品溶液，按上述色譜條件進行試驗，HPLC-ELSD圖如下圖2。峰型良好，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 地榆皂苷-Ⅱ色譜圖（對照品溶液、空白溶劑、供試品溶液）

2.2.4 標準曲線制備 分別精密移取不同濃度對照品溶液各10 μL（0.1008，0.2016，0.3024，0.4032，0.5040，1.0080 mg·mL-1），按2.2.3項下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積積分值的對數Y為縱坐標，對照品濃度對數X為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=1.7463X+2.0059(r=0.999 1)，表明地榆皂苷-Ⅱ在0.1008～1.0080 mg·mL-1范圍內呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度考察 取地榆皂苷-Ⅱ對照品溶液、地榆供試品溶液分別重復進樣6次，按2.2.3色譜條件，測得地榆皂苷-Ⅱ峰面積的RSD為1.03%，地榆供試品溶液地榆皂苷-Ⅱ峰面積的RSD為1.87%。表明在該色譜條件下儀器精密度良好。

2.2.6 重復性考察 精密移取2.2.2項下供試品溶液6份，按2.2.3色譜條件測定，RSD=1.91%，表明該方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密移取2.2.2項下供試品溶液6份，按2.2.3色譜條件分別在0、2、4、12、24、48 h測定，RSD=1.81%，表明該供試品溶液在48 h內穩定。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取己知含量的地榆藥材粉末9份，每份約1 g，分別精密加入高、中、低含量的地榆皂苷-Ⅰ對照品溶液，每個含量平行測定3份，按2.2.2項下供試品溶液制備，按2.2.3項下色譜條件進行測定，結果地榆皂苷-Ⅱ的平均加樣同收率為99.7%，RSD為1.91%。表明該方法準確度良好，見表2。

表2 HPLC-ELSD法測定地榆皂苷-Ⅱ加樣回收率結果

2.3 響應面優化實驗

2.3.1響應面實驗設計

在查閱文獻[13-15]的基礎上，以乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取時間（C）為考察因素，因素水平表見表3，以地榆皂苷-Ⅰ和地榆皂苷Ⅱ提取量（Y）的綜合評分為指標，Y=地榆皂苷-Ⅰ/Max地榆皂苷-Ⅰ×50+地榆皂苷Ⅱ/Max地榆皂苷-Ⅰ×50，采用Box-Behnken設計方法設計試驗，試驗設計見表4。實驗方法，稱取地榆粉末10 g，按相應的條件超聲提取。

表3 因素與水平

表4 黃芪甲苷提取工藝Box-Behnken試驗設計

使用統計軟件Design-Expert8.0.6，對表4中數據進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程模型：Y=99.94-15.46A+4.90B+2.80C-0.84AB-0.17AC+1.58BC-16.70A2-6.87B2-6.11C2（r=0.9887，P＜0.01）。統計學方差分析見表5。

表5 響應面模型方差分析

純誤差 0.015 4總和 3884.51 16

由方差分析結果可知，模型能解釋98.87%的響應值變化，回歸方程擬合較好，分析結果可靠。三個因素分別對綜合評分影響的順序為A＞B＞C，模型P＜0.0001，表明該回歸方程擬合情況良好，能準確預測實際情況。模擬方程繪制響應面等高圖和3D圖，如圖3。

由上圖可知，因素A的曲面較陡峭，且等高線較緊密，說明因素A對響應值影響最顯著；當因素A一定時，增加因素B，響應值先增加后降低；B和C曲面較平緩，等高線疏松，說明因素B和C的交互作用對響應值無顯著性影響，這與方差分析結果一致。經Design-Expert軟件優化得最佳提取工藝為乙醇濃度77.4%，料液比7.6倍，提取時間28.6 min。考慮到大生產的實際可操作性，調整工藝參數為乙醇濃度80%，料液比8倍，提取時間30 min。

2.4 驗證實驗

按以上優化結果乙醇濃度80%，料液比8倍，提取時間30 min，進行3 次驗證試驗，結果地榆皂苷-Ⅰ的含量分別為60.972，61.088，61.094 mg·g-1，平均值為61.051 mg·g-1；地榆皂苷-Ⅱ的含量分別為5.300，5.303，5.295 mg·g-1，平均值為5.299 mg·g-1。與理論預測值相比，其相對誤差小于5%，驗證值與回歸方程預測值吻合較好，說明該模型有良好的預測性。

圖3 響應面等高圖和3D圖

3 討論

本實驗采用乙醇直接從地榆藥材中提取地榆皂苷成分，經響應面法優化提取工藝，工藝參數為乙醇濃度80%，料液比8倍，提取時間30 min，與其他文獻報道，地榆皂苷提取量提高。本實驗采用Box-Behnken設計，其充分考慮到各因素的交互作用，設計方法簡單，試驗次數少，在中心點進行重復試驗以提高試驗精度，同時采用非線性模型擬合，可信度較好，預測值更接近真實值。經驗證試驗驗證結果可知，本工藝穩定可行，為工業化大生產提供了科學依據。

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