從抗炎鎮痛解熱作用初步探究三黃瀉心湯復方合煎制備工藝科學內涵

陳哲杰，王靜，甘帥，李杰，王瀟，成彥芬，李文*

三黃瀉心湯又名“三黃湯”“伊尹三黃湯”，全方由大黃、黃連、黃芩組成，大黃為君藥，導熱下行，以瀉代清，止血而不留瘀，主瀉下焦之火。黃連、黃芩具清熱燥濕、瀉火解毒之功，分清上、下焦之火，共為臣藥，輔助大黃。三藥配伍，既相互策應又各有側重，直清上、中、下三焦之火。三黃瀉心湯為中醫臨床治療火熱壅盛、吐衄之經方。現代有研究認為三黃瀉心湯復方合煎會產生大量沉淀物[1]，并且影響三黃瀉心湯所含藥材有效物質的溶出率[2]。然而亦有研究證實三黃瀉心湯復方合煎所產生的沉淀物具有與湯液一樣的生理活性，應將沉淀看作其藥效物質基礎的一部分加以利用[3]。傳統三黃瀉心湯亦有“頓服”的要求，《簡明中醫辭典》認為“頓服”為將藥液一次性較快的服下，這樣使得三黃瀉心湯所含沉淀物能在胃腸被人體吸收利用。目前應用于中醫臨床的傳統三黃瀉心湯湯劑仍采用以水為溶媒的復方合煎制備，然而相關中成藥開發過程中，為避免藥材復方合煎過程中有效成分產生“絮狀物”被除去，放棄了沿用千年的三黃瀉心湯制備古法，采用分煎藥材的制備工藝。

三黃瀉心湯臨床主要用于火熱壅盛所致諸癥的治療。現代研究表明，火熱壅盛可引起諸多身體病理反應，其中與炎癥、疼痛、體溫升高關系密切[4]。故本文以最為簡單、最為直接的抗炎、解熱、鎮痛試驗作為對三黃瀉心湯處方藥材單煎液、分煎合并液、合煎液藥理作用差異評價切入點，在不去除各組湯液沉淀的情況下，模仿傳統三黃瀉心湯“頓服”用法分別對動物進行給藥，通過對各組的抗炎、鎮痛、解熱作用差異研究，以期初步探究三黃瀉心湯復方合煎的科學內涵，為該方在現代研究與制劑開發中制備工藝的確定提供相關參考。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

大黃Rheum offcinaleBaill.（批號：G00216P01）、黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi（批號：G03816L01）、黃連CoptischinensisFranch.（批號：G03616P01）均購自四川中庸藥業有限公司，經檢查藥材的各項指標均符合《中華人民共和國藥典》2015版規定項下要求。阿司匹林腸溶片（批號：170202）購自北京中新藥業股份有限公司；大鼠超氧化物歧化酶（SOD，批號：20171109）、大鼠丙二醛（MDA，批號：20171027）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號：238270925）購自聯科生物；大鼠前列腺素E2（PGE2，批號：C0189020116）購自華美生物；角叉菜膠（批號：10013887572）、內毒素（批號：0599234）購自于Sigma公司；干酵母（批號：20170728）購自北京奧博星生物技術有限責任公司、購自于Sigma公司；二甲苯、冰醋酸均購置于四川科龍化工試劑廠。

1.2 試驗儀器

Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機（Heal Force公司）；Chemray 240全自動生化分析儀（深圳雷杜生命科技）；RE52-99旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；Forma-86C超低溫冰箱（美國Thermo集團）；Epoch全波長酶標儀（美國BioTeK公司）；DY89-Ⅱ電動勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；PL-203MC-34電子體溫計（歐姆龍大連有限公司）。

1.3 試驗動物

SD大鼠，體重200±20g；昆明種小鼠，體重20±2g，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（川）2015-030。動物購入后檢疫與馴化飼養7 d，使其適應新環境并剔除體質量差異較大的動物，并在室溫18～24 ℃、濕度40%～50%條件下飼養，實驗期間動物自由進食、飲水，晝夜節律正常。

2 方法

2.1 受試藥物的制備

2.1.1 三黃瀉心湯合煎液的制備 大黃100 g、黃芩50 g、黃連50 g，用8倍量水加熱回流提取3次，每次1h，合并提取液，濃縮至500 mL，即生藥計量為0.4 g·mL-1。按古方成人日服三黃瀉心湯處方生藥劑量為60 g計[5]，通過換算確定小鼠灌胃劑量為22.75 mL·kg-1(按生藥計為9.1 g·kg-1）。大鼠的灌胃劑量為15.75 mL·kg-1（按生藥計為6.3 g·kg-1）。

2.1.2 三黃瀉心湯分煎合并液的制備 大黃100 g、黃芩50 g、黃連50 g，分別用8倍量水加熱回流提取3次，每次1 h，分別濃縮后冷卻致室溫后合并煎液并定容至500 mL，即生藥計量為0.4 g·mL-1。同“2.1.1”項下，通過換算確定小鼠灌胃量為22.75 mL·kg-1(按生藥計為9.1 g·kg-1）。大鼠的灌胃劑量為15.75 mL·kg-1（按生藥計為6.3 g·kg-1）。

2.1.3 藥材單煎液的制備 大黃100 g、黃芩50 g、黃連50 g，分別用8倍量水加熱回流提取3次，每次1 h，分別濃縮后冷卻致室溫后分別濃縮至500 mL。每種單煎液劑量為小鼠灌胃量為22.75 mL·kg-1(按生藥計分別為4.55 g·kg-1、2.275 g·kg-1、2.275 g·kg-1）。大鼠的灌胃計量為15.75 mL·kg-1（按生藥計分別為3.15 g·kg-1、1.575 g·kg-1、1.575 g·kg-1）。

2.1.4 阿司匹林溶液的制備 取阿司匹林腸溶片適量，于研缽碾碎，加入適量純水繼續碾磨，將阿司匹林腸溶片配置為濃度為0.014 g·mL-1的溶液，小鼠灌胃劑量為14.29 mL·kg-1，（按阿司匹林腸溶片計算為0.2 g·kg-1）。大鼠的灌胃劑量為10 mL·kg-1，（按阿司匹林腸溶片計算為0.14 g·kg-1）[6]。

2.2 二甲苯致小鼠耳腫脹試驗

取雄性昆明種小鼠70只，隨機分為7組，每組10只，分別為生理鹽水組、阿司匹林陽性對照組、大黃組、黃連組、黃芩組、三黃瀉心湯分煎合并組、三黃瀉心湯合煎組，各給藥組灌胃相應體積藥物，生理鹽水組灌胃相應體積生理鹽水，1次/d，連續7 d，于末次給藥后30 min，用二甲苯30 μL均勻涂抹每只鼠左耳兩面致炎，右耳作為對照。致炎15 min脫頸椎處死小鼠，以6 mm直徑打孔器取下耳緣左、右耳片，精密稱取質量，以左、右耳片質量差表示腫脹度，并計算腫脹抑制率[7]。

腫脹度=左耳耳片質量(mg)－右耳耳片質量(mg)

2.3 角叉菜膠致大鼠足腫脹試驗

將80只雄性SD大鼠，隨機分為8組，每組10只，分別為正常組、生理鹽水組、阿司匹林陽性對照組、大黃組、黃連組、黃芩組、三黃瀉心湯分煎合并組、三黃瀉心湯合煎組，各藥物組灌胃相應體積的藥物，正常對照組與生理鹽水組灌胃相應體積生理鹽水，1次/d，連續7 d。末次給藥后測定右足跖致炎前的體積并于30 min后，在各組大鼠右后足跖皮下注射1 %角叉菜膠0.1 mL致炎（正常組大鼠除外），在致炎后3 h用足容積測量器測定右足趾致炎后的體積，以致炎前后體積差為足趾腫脹度。大鼠股動脈取血后全血3000 r·min-1離心15 min，取上層血清置于4 ℃冰箱中冷藏備用，按照試劑盒說明書對血清中MDA、SOD進行檢測。脫頸椎處死大鼠，并剪下大鼠炎癥右后足，稱量質量，以預冷的生理鹽水為勻漿介質，制備成10%的組織勻漿，于4℃下3000 r·min-1離心15 min，取上清液待用，后按照試劑盒操作說明書對炎癥組織中PGE2、TNF-α進行檢測。

2.4 小鼠醋酸扭體試驗

取雄性昆明種小鼠70只，體重20±2 g，分組及給藥同“2.2”項下，灌胃給藥，1次/d，連續7 d。末次給藥30 min后，各組小鼠腹腔注射1 %冰醋酸溶液10 mL·kg-1，觀察15 min 內小鼠的扭體反應(小鼠腹部內凹，后肢與軀干伸張，同時臀部高起)次數，并計算鎮痛率。

2.5 小鼠熱板試驗

取雌性昆明種小鼠70只，體重20±2 g，分組及給藥同“2.2” 項下。小鼠置(55 ±0.5) ℃水浴的鋁盤上，以舔后足及抬后足并回頭為痛反應指標，記錄痛反應出現的時間（痛閾值），測定2次平均值在5～30 s之間且不跳躍的小鼠供實驗用。并將平均值作為給藥前痛閾值。連續給藥7 d。末次給藥后以同樣方法測定30、60、90 min各小鼠的痛閾值，痛閾值若超過60 s則以60 s計，計算各組小鼠的痛閾提高率。

痛閥反應提高百分率=(給藥后痛反應時間-藥前痛反應時間)/給藥前痛反應時間×100%

2.6 內毒素致大鼠發熱實驗

雄性SD大鼠70只，體重200±20 g，先測定體溫2 d，實驗當日測定基礎體溫2次，篩選2次基礎體溫差值＜0.3 ℃的大鼠供實驗用，并取其平均值作為基礎體溫，合格大鼠隨機分為7組，每組10只，分別為生理鹽水組、阿司匹林陽性對照組、大黃組、黃連組、黃芩組、三黃瀉心湯分煎合并組、三黃瀉心湯合煎組，各給藥組灌胃相應體積的藥物1次/d，連續7 d。末次給藥后1 h各組大鼠均腹腔注射內毒素80 μg·kg-1，測定注射內毒素后1、2、3、4、5 h大鼠體溫，計算各組大鼠在不同時間點的體溫變化。

2.7 干酵母致大鼠發熱實驗

雄性SD大鼠70只，體重200±20 g，實驗前用電子體溫計測量正常肛溫3次，取3次平均值作為大鼠的基礎體溫，選取體溫在36～38 ℃的大鼠，分組及給藥同“2.6” 項下，給藥7 d，實驗當天于背部皮下注射20%酵母懸液10 mL·kg-1。測定給藥后1、2、3、4、5、6 h大鼠體溫，計算各時間點各組大鼠體溫變化[8]。

2.8 數據統計學處理

用SPSS 19.0統計學軟件進行數據統計。數據以表示。模型組與各劑量組間的比較采用方差分析LSD法，等級資料采用秩和檢驗。

3 結果

3.1 二甲苯致小鼠耳腫脹試驗結果

如表1所示，與生理鹽水組小鼠相比，黃連單煎液對二甲苯所致的小鼠耳腫脹無明顯的抑制作用，大黃單煎液、黃芩單煎液對小鼠耳腫脹具有一定的抑制作用（P＜0.05）；三黃瀉心湯合煎液與分煎合并液均能顯著抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹（P＜0.01），但三黃瀉心湯合煎液的抑制效果要優于三黃瀉心湯分煎合并液。

表1 各組對二甲苯致小鼠耳腫的影響（x±s, n=10）

表2 各組對角菜叉膠致大鼠足腫脹的影響（x±s, n=10）

3.2 角叉菜膠致大鼠足腫脹試驗結果

如表2所示，與正常組大鼠相比，生理鹽水組大鼠足腫脹度顯著升高（P＜0.01），血漿中的SOD活性顯著降低（P＜0.01），MDA含量顯著升高（P＜0.01），炎癥組織中TNF-α、PGE2的含量顯著升高（P＜0.01）。與生理鹽水組大鼠相比，黃連單煎液、黃芩單煎液不能有效抑制角叉菜膠引起的大鼠足腫脹，大黃單煎液不能顯著的提高大鼠血漿中SOD的活性；三黃瀉心湯合煎液能顯著提高大鼠血清中SOD活性（P＜0.01），但分煎合并液未能顯著提高大鼠SOD活性。此外三黃瀉心湯合煎液與分煎合并液均能顯著降低大鼠血清中MDA含量（P＜0.01），并能顯著減少炎癥組織中TNF-α、PGE2含量（P＜0.01）。三黃瀉心湯分煎合并液與合煎液相比在抑制大鼠足腫脹、提高SOD活性、降低TNF-α含量方面均不如合煎液，且存在顯著性差異（P＜0.05）。

3.3 小鼠醋酸扭體試驗結果

如表3所示，與生理鹽水組相比，大黃單煎液、黃連單煎液灌胃能降低醋酸腹腔注射所引起的小鼠扭體反應（P＜0.01），但黃連單煎液對小鼠醋酸腹腔注射所致的扭體反應抑制效果不明顯；三黃瀉心湯合煎液與三黃瀉心湯分煎合并液均能顯著的降低醋酸腹腔注射所致的小鼠扭體反應（P＜0.01），但三黃瀉心湯合煎液對小鼠醋酸腹腔注射所致的扭體反應抑制效果要優于三黃瀉心湯分煎合并液（P＜0.05）。

表3 各組對醋酸致小鼠扭體反應的影響（x±s, n=10）

注：與生理鹽水組相比，**P＜0.01；*P＜0.05；與合煎組相比，#P＜0.05; ##P＜0.01

3.4 小鼠熱板試驗結果

如表4所示，與生理鹽水組相比，單味藥材煎液灌胃均未能有效延長小鼠的舔足潛伏期。三黃瀉心湯合煎液能顯著延長30、60、90 min時小鼠的舔足潛伏期（P＜0.01），而三黃瀉心湯分煎合并液只能在30 min與90 min時延長小鼠舔足潛伏期（P＜0.05）。因此可以認為在延長小鼠舔足潛伏期的作用上三黃瀉心湯合煎液要優于三黃瀉心湯分煎合并液，亦優于單味藥材煎液。

表4 各組對熱刺激致小鼠疼痛反應的影響（x±s, n=10）

3.5 內毒素致大鼠發熱試驗結果

如表5所示，與生理鹽水組相比，三黃瀉心湯分煎合并液于給藥后2 h就顯示出顯著降低大鼠體溫的效果（P＜0.01），三黃瀉心湯合煎液（P＜0.01）與黃芩單煎液（P＜0.05）于給藥后3 h體現出了降低大鼠體溫的效果，給藥3 h后三黃瀉心湯合煎液為降溫效果最佳的一組（除陽性組外）。各給藥組于給藥后4、5 h均能顯著性的降低內毒素所致的大鼠發熱。

表5 各組對內毒素致大鼠發熱的影響（x±s, n=10）

3.6 干酵母致大鼠發熱試驗結果

如表6所示，與生理鹽水組相比，給藥1 h后各給藥組均能顯著性的降低大鼠體溫。給藥2 h后，隨著生理鹽水組大鼠體溫升高幅度減小，黃連單煎液組對大鼠體溫的降低作用不顯著。給藥3 h后，大黃單煎液對大鼠體溫的降低作用不顯著。三黃瀉心湯合煎液、三黃瀉心湯分煎合并液、黃芩單煎液于給藥后的1～6 h均顯示出顯著的降低大鼠體溫的藥理作用效果（P＜0.01），其對大鼠體溫降低幅度由高到低排序為：合煎液＞分煎合并液＞黃芩單煎液。

表6 各組對干酵母致大鼠發熱的影響（x±s, n=10）

4 總結與討論

通過試驗對三黃瀉心湯處方藥材單煎液、分煎合并液、復方合煎液的抗炎、鎮痛、解熱效果進行了比較。結果顯示，在各項試驗中分煎合并液的整體效果優于藥材單煎液，說明三黃瀉心湯處方所含的三味藥材通過復方組合在發揮抗炎、解熱、鎮痛藥理作用的過程中有協同增效的作用。同時，三黃瀉心湯復方合煎液的整體抗炎、鎮痛、解熱藥效要優于分煎合并液，證明三黃瀉心湯處方藥材通過合煎過程物質基礎發生了復雜的理化變化，其中一部分有效物質以絮狀沉淀的形式存在，從而增強了該方藥效。由此可初窺三黃瀉心湯處方藥味組合有其道理，而傳統的三黃瀉心湯復方合煎制備工藝也有其科學內涵。

在現代制劑的開發過程中，如何保證制劑開發的安全性、有效性、科學性一直是中醫經典方劑開發的重點與難點。三黃瀉心湯作為經方，在開發過程中是否要采取傳統經典的復方合煎制備工藝一直存在疑問。本文僅從藥效學的角度證明了三黃瀉心湯處方藥材單煎液、分煎合并液、復方合煎液在抗炎、鎮痛、解熱作用方面的差異，初步證明了三黃瀉心湯復方合煎的科學性，為三黃瀉心湯在現代開發中提取工藝的確定提供了參考。而各組煎液的藥效學差異必定是由其物質基礎所決定的，還有待于對單味藥單煎液、單煎合并液、復方合煎液進行化學成分的研究，找出化學成分變化與藥效作用變化之前的關聯性，以更全面地為三黃瀉心湯的工藝研究、成藥開發、臨床使用提供科學理論基礎。

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