通過監測哺乳仔豬帶毒情況來評估母豬群藍耳病病毒感染狀況的最新研究

姚 晶，王科文

[碩騰（上海）企業管理有限公司，上海 長寧 200050]

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV，俗稱藍耳病病毒）是引起全球養豬行業重大經濟損失的病原之一。PRRSV每年給美國養豬業帶來的經濟損失達10億美元以上[1]，按照此標準估計中國每年因PRRSV造成的損失大約為50億美元以上（中國出欄量為美國的5倍多）。然而，控制和凈化PRRSV的關鍵一步是切斷PRRSV在種豬群的循環，如此養豬生產體系才能生產出藍耳病斷奶陰性仔豬[2]。因此，有效地監測種豬群的PRRSV感染狀況（母豬感染狀況分類）對評估藍耳病（PRRS）控制與凈化效果是非常必要的。例如在PRRSV凈化項目中，評估其進展通用的一個標準是斷奶仔豬檢不出病毒所需要的時間。

在過去幾年里，隨著采樣方法和診斷技術的不斷改進，豬場樣品采集工作變得更加便捷。當前養豬行業對哺乳仔豬PRRSV的監測主要為血清混合樣本檢測，但是，在低感染率的情況下，哺乳仔豬血清混合樣本對PRRSV循環的檢測敏感性較低。為了提高種豬群PRRSV的檢出率，養豬行業需要一個更好的檢測方法。這種檢測方法在保證準確性、可操作性以及成本低的情況下，檢測的樣本量更大、檢測更頻繁。因此，先是發展了更為方便可靠的口腔液樣本采集檢測法，該方法目前多是用在生長肥育豬以及種豬群樣本的采集，而在哺乳仔豬上的使用比較少。然而，獸醫和生產者仍然不斷地追求更敏感、更便宜、更快的樣本采集方法。最近又提出了一種樣本采集新方法，即處理液（日常仔豬處理時斷尾、公豬閹割濾出的液體，通常在7日齡內）樣本的采集法，處理液樣本采集法可以滿足人們對檢測方法敏感、低成本、快捷的需求。

本文將主要介紹口腔液樣本檢測法和組織液檢測法在哺乳仔豬監測PRRSV帶毒情況的最新研究進展。

1 母豬場PRRSV感染狀態分類的重要性及其采樣檢測方法的調查

美國明尼蘇達大學 MSHMP項目（Morrison Swine Health Monitoring Program）對母豬PRRS感染狀態分類的重要性及其采樣檢測方法進行了調查[3]。該調查的對象為美國13生產體系的21位獸醫工作者（這些獸醫們服務的母豬群約為150萬）。其中12/21（57%）和8/21（38%）的獸醫分別認為母豬群感染狀態的分類非常重要和重要，只有1位獸醫認為其不重要。另一方面，對他們采取采樣檢測方法的調查結果表明，他們更多的是采用哺乳仔豬血液樣本進行檢測（17/21，81%），其次是采用處理液樣本（11/21，52%）；一些獸醫們在采集哺乳仔豬血液的同時，也采集處理液樣本進行組合檢測（8/21，38%）；而單純使用哺乳仔豬血液樣本進行檢測的獸醫比例為33%（7/21）；具體調查結果見圖1[3]。從圖1可以看出，主要的采樣檢測樣本為哺乳仔豬血樣和處理液樣本，其次是母豬血樣和口腔液樣本（包括母仔口腔唾液）。雖然，調查結果表明哺乳仔豬血液樣本采集比例仍然是很高，但是其作為傳統的藍耳病監測方法不僅費時、費力、費錢，而且還會引起仔豬應激甚至死亡。

圖1 PRRS感染狀態分類所采集不同樣本的調查

2 口腔唾液（Oral fluids）樣本的檢測

目前有較多關于口腔唾液樣本檢測的文獻報道。相對于費時費力費錢的血液樣本，口腔唾液樣本是一種成本效益好的、動物福利好的替代基于血清的監測樣本。很多病原均可以在豬的口腔液中檢測到，比如圓環病毒2型[4]、豬流感病毒[5]以及豬丹毒桿菌[6]等；在PRRSV方面，也有相關文獻報道了相關研究[7-9]。目前，很多研究均表明基于口腔唾液的PRRSV監控在豬場是很實用的，因為口腔唾液樣本采集方便及其診斷方法優化也方便。

雖然在生長肥育豬以及成年豬采集口腔唾液已經有很多相關文獻報道，但是在采集哺乳仔豬口腔唾液方面的文獻報告卻很少。那么采集哺乳仔豬口腔唾液樣本來監控母豬群PRRSV感染狀況是否可行呢？

Graham等（2013）檢測了一個豬群斷奶前仔豬血樣（44窩仔豬，共454份仔豬血樣）以及每窩的口腔唾液樣本；檢測結果表明有兩窩仔豬為PRRSV陽性，其中一窩里面只有1頭仔豬血樣為PRRSV陽性，而另一窩里面有2頭仔豬血樣為PRRSV陽性[10]；同樣，Cano等（2008）對42窩仔豬的口腔唾液進行RT-PCR檢測，其中檢出13窩仔豬為PRRSV陽性；這13窩仔豬中有8窩包含有1頭PRRSV陽性仔豬，2窩包含有2個PRRSV仔豬陽性，3窩包含有4頭以上仔豬PRRSV陽性[11]。

雖然口腔唾液采樣法是非常方便、快捷、低成本并可靠的采樣方法，但是從哺乳仔豬獲取口腔唾液樣本并不是那么容易。口腔液的檢測在生長豬以及成年豬（公豬、后備豬以及經產母豬）已經得到了成功的探索，而針對如何更好地獲取哺乳仔豬口腔唾液的相關數據較少。

Marcelo等[12]在建立哺乳仔豬口腔唾液成功收集的標準流程方面作相關的研究。他們探索了不同采樣方式[母仔共用唾液采集繩（Family oral fluids）和只有仔豬有采集繩]、采集繩中加不同誘食劑、不同采樣時間以及不同繩子長度情況下，口腔唾液樣本的成功采集率（最終收集到的唾液體積在0.5毫升以上）；經過他們的試驗最終在提高采集哺乳仔豬口腔唾液樣本成功率方面提出如下建議：1）仔豬日齡。3周齡以上仔豬比低日齡哺乳仔豬的采集成功率更高。2）采集時間。采集時間越早，成功率越高（最好在早上6：00之前）。3）不同采樣方式。相對于只有仔豬能咬到采集繩，母仔共用采集繩明顯可以提高采集樣品的成功率；母豬起到教導的作用。4）誘食劑。在采集繩上涂花生醬略微地改善采集成功率。5）繩子高度。越靠近地板越容易采集到唾液樣本。6）采集前訓練仔豬。采集樣本前訓練哺乳仔豬可以提高樣本采集成功率。

同時Marcelo等[12]比較了72窩母仔口腔唾液和窩內所有仔豬單個血清樣本（699份）之間PRRSV rRT-PCR檢測結果，最終檢測結果顯示血清樣本陽性率為 24.6%（172/699），而將近一半窩數[44.4%（32/72）]仔豬中至少有1頭PRRSV陽性仔豬；這32窩仔豬的母仔口腔唾液的陽性率為84.4%（27/32）；其中窩里含有3頭或以上的PRRSV陽性仔豬的母仔口腔唾液也均為陽性，而窩里只有1頭或2頭的PRRSV陽性仔豬母仔口腔唾液陽性率為50%。因此，母仔口腔唾液的PRRSV核酸檢測也可以很好地（成本低、更頻繁、更多樣本）用于哺乳仔豬PRRSV的監控。

3 采用處理液（Processing fluids）樣本監測母豬群PRRSV感染狀況

首先，處理液樣本的定義為仔豬閹割和剪尾處理后的睪丸、尾巴等組織滲出液的混合樣本。因為早已有研究表明PRRSV可以在睪丸上皮細胞和巨噬細胞里復制[13]，所以從理論上來講處理液可能是PRRSV監控的合適樣本。目前已有一些研究表明處理液可以很好地作為監測PRRSV的樣本。

美國MSHMP項目在2017年發表相關研究課題，評估了處理液熒光定量PCR檢測PRRSV來評估母豬群PRRSV感染狀態的準確性，結果表明，處理液是一種用于檢測哺乳仔豬PRRSV非常敏感有效的樣本（只要有1頭PRRSV陽性豬的處理組織在樣本中，處理液的檢測結果即能檢出陽性），而且低胎次（1～2胎）母豬和高胎次（2胎以上）母豬之間存在顯著差異，低胎次母豬陽性率更高。

Lopez等初步研究表明，與單個血清樣本合樣和尾巴血液拭子相比，處理液具有更高的PRRSV檢出率[14]。處理液的檢出率為66%（21/32），而對應的單個樣本（血清和尾巴血拭子）合樣具有更低的檢出率，為31%（10/32）；豬場員工采集處理液操作起來更方便，采樣成功率為100%，而且采集樣本量足夠進行多個檢測。他們從18個陽性樣本中獲得15個PRRSV基因序列，這也說明PRRSV RNA在處理液里相對比較穩定，而且有很高的核酸量。

此外，處理液由閹割和斷尾處理過程生成，那么這兩種不同的處理液對PRRSV的檢出率是否會有不一樣呢？Hood等對比了使用睪丸和尾巴制成的兩種處理液藍耳的監測情況。他們選取了北卡羅萊納州（美國東南部）7個不同的母豬場作為研究試驗場，而且這些場都經過血清學診斷為PRRS不穩定豬場；每種處理液各采集了32份樣品，用熒光定量PCR的檢測方法檢測，并分析其Ct值（循環閾值）；最終結果表明，睪丸處理液的檢出率（53.1%）比斷尾處理液（31.3%）高，而且睪丸處理液的Ct值比斷尾處理液明顯要低（說明病毒核酸含量更高）[15]。

PRRSV在豬群越來越穩定的時候，感染率也是越來越低，那么對于這種感染率低的豬群是否也能夠很好地檢測出來呢？Jacob等做了一些研究來探索很低感染率的情況下的處理液的檢出率：首先他選取了已知PRRSV陽性的豬場并采集尾巴和睪丸處理液，同時采集已知PRRSV陰性豬場并采集其處理液（10窩1組，多組，PCR確定陰性）；然后將1份PRRSV 陽性處理液（Ct 22.06） 置于 10、20、30、40、50窩PRRSV陰性處理液中，取每個稀釋度樣本去做PCR檢測；所有的PCR檢測結果均為陽性；另外將1份不同Ct值的 PRRSV陽性處理液（Ct 33.56）做類似的試驗，發現前面4個稀釋度都是陽性，而50窩稀釋度為PRRSV陰性。因此從其研究結果可看出，即使在非常低的流行率情況下，仍然能夠檢測出來PRRSV；但是Ct值也是會影響PRRSV的檢出率的[16]。

因此，基于處理液的樣本采集是篩查豬群藍耳病的一個簡單、快速、有效方法；豬場在進行PRRSV監控時，采集處理液判斷豬群生產的仔豬是否到達陰性。當豬場持續監測到PRRSV循環（陽性處理液）時，警示豬場管理者和員工采取進一步管理措施阻止病毒在豬群的循環，避免PRRSV在豬群的進一步傳播。

[1]Holtkamp D J,Kliebenstein J B,Neumann E J,et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers[J].J Swine Heal Prod,2013,21(2)：72-84.

[2]Corzo C A,Mondaca E,Wayne S,et al.Control and elimination of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Virus Res,2010,154(1-2)：185-192.

[3]Sanhueza J M,Vilalta C,Geary E,et al.Sow farm PRRS status classification survey[J].Morrison Swine Health Monitoring,2018,04.06.https：//z.umn.edu/SciencePages

[4]Prickett J R,Johnson J,Murtaugh M P,et al.Prolonged detection of PCV2 and anti-PCV2 antibody in oral fluids following experimental inoculation[J].Transbound Emerg Dis,2011,58：121-127.

[5]Panyasing Y,Goodell C K,Wang C,et al.Detection of influenza A virus nucleoprotein antibodies in oral fluid specimens from pigs infected under experimental conditions using a blocking ELISA[J].Transbound Emerg Dis,2014,61(2)：177-184.

[6]Gimenez-Lirola L G,Xiao C T,Zavala M,et al.Improving ante mortem diagnosis of erysipelothrix rhusiopathiae infection by use of oral fluids for bacterial,nucleic acid,and antibody detection[J].J Microbiol Methods,2013,92：113-121.

[7]Kittawornrat A,Prickett J,Chittick W,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)in serum and oral fluid samples from individual boars：will oral fluid replace serum for PRRSV surveillance?[J].Virus Res,2010,154：170-176.

[8]Prickett J,Simer R,Christopher-Hennings J,et al.Detection of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in porcine oral fluid samples：a longitudinal study under experimental conditions[J].J Vet Diagn Invest,2008a,20,156-163.

[9]Prickett J,Simer R,Yoon K J,et al.Surveillance of commercial growing pigs for PRRSV and PCV2 infections using pen-based oral fluid samples：a pilot study[J].Swine Health Prod,2008b,16：86-91.

[10]Graham J,Rademacher C,Swalla R.Use of oral fluid sampling in suckling pigs for PRRSV monitoring[C].Proceedings Seminar of American Association of Swine Veterinarians,San Diego,CA,2013：83-89.

[11]Cano J P,Dee S A,Rovira A,et al.PRRSV vertical transmission dynamics in an endemically infected sow-herd[C]//In：Proceedings Seminar of American Association of Swine Veterinarians,San Diego,CA,2008：105.

[12]Marcelo A,Jeffrey Z,Derald H,et al.Comparative evaluation of family oral fluids and piglet sera to detect PRRSV RNA by PCR[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：339.

[13]Sur J H,Doster A R,Christian J S,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus replicates in testicular germ cells,alters spermatogenesis,and induces germ cell death by apoptosis[J].J Virol,1997,71(12)：9170-9179.

[14]Will A,Jose A,Clayton J,et al.Processing fluids for PRRSV monitoring and surveillance systems[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：61.

[15]Hood M,S Hough,J.Angulo,et al.Comparison of the use of tails versus testicles in the production of processing fluids for detection of PRRSV[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：99.

[16]Jacob B,Deb M,Amanda S,et al.Utilizing piglet-processing fluids to detect PRRSV by PCR in a low-prevalence population[C].Global knowledge：Individual Application.San Diego,49th AASV Annual Meeting,2018：95.