一株蘇云金芽孢桿菌自然突變體活性喪失的研究

魏敏

摘要：通過對一株蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）自然突變體cry1C基因的克隆和測序，分析突變位點對該基因所表達蛋白質結構的影響及活性喪失的原因。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）；突變體；活性

中圖分類號：S476.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2018）08-0069-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.08.018

Study on the Loss of Natural Mutant of A Bacillus thuringiensis

WEI Min

（Henan Nursing Vocational College，Anyang 455000，Henan，China）

Abstract： The cry1C gene of a mutant Bacillus thuringiensis natural mutant were cloned and sequenced， and the effects of mutant sites on the protein structure expressed were analyzed by this gene and the causes of loss of activity.

Key words： Bacillus thuringiensis； mutant； activity

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）簡稱Bt，其產生的殺蟲晶體蛋白對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等多種重要的農林業害蟲以及線蟲、螨類和原生動物具有毒殺作用[1]。菌株G43對夜蛾科害蟲甜菜夜蛾有較好的活性，推測其可能含有cry1C類基因[2]，但其基因的具體序列還不清楚。在傳代過程中發現其殺蟲活性完全喪失，把突變體命名為G39，分析可能是其表達殺蟲晶體蛋白的cry基因發生了突變，導致其不能正確地表達殺蟲晶體蛋白，造成殺蟲活性喪失，為明確該基因發生突變的位點，對該菌株中的cry1C基因及其突變體G39菌株中的基因進行克隆并測序[3，4]，分析其突變位點對該基因表達蛋白構象的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

所用Bt菌株均由中國農業科學院植物保護研究所生物技術組保存；JM109購自Novagen；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

液體LB：Tryptone 1%，Yeast extract 0.5%，NaCl 1%，pH 7.0，120 ℃ 20 min。

酶類：限制性內切酶及連接酶、高保真KOD plus DNA聚合酶、Rnase購自GiBcol、TaKaRa公司。dNTP、Taq酶等購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。DNA回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

Bt總DNA提取液：溶液I，0.3%蔗糖，25 mmol/L Tris·Cl（pH 8.0），25 mmol/L EDTA（pH 8.0），Lysozyme 50 mg/mL；溶液II，0.1 mol/L NaCl，0.1% SDS，0.1 mol/L Tris·Cl（pH 8.0）；溶液III，5 mol/L NaAc，用冰乙酸調至pH 4.8。

1.2 方法

Bt總DNA提取、PCR擴增、基因克隆、質粒提取均為常規方法。

2 結果與分析

2.1 Bt菌株G43和G39中cry1C基因的克隆

以菌株G43和G39的總DNA為模版，用cry1C的鑒定引物[1]5′-GTTTAGTGTTGGACGCAATTT-3′和5′-CCAGCGCCACCATTTAA-3′擴增檢測出菌株G43和G39中確實含有cry1C類基因（圖1）。

用全長引物5′-ATGGAGAATAATATTCAAAAT CAATGC-3′和5′-GGAATTACTCCTTATGGAGGAAT AA-3′和KOD plus DNA聚合酶擴增得到全長3.5 kb cry1C的全長DNA（圖2）。

將產物回收、純化，利用Taq DNA聚合酶延伸加“A”尾。最終PCR產物經回收純化后插入pMD18-T載體中，轉化E.coli JM109，挑取陽性克隆并提取質粒，對該質粒進行酶切鑒定（圖3）。

2.2 Bt菌株G43和G39中cry1C基因的序列測定及分析

對經過PCR和酶切鑒定的陽性克隆進行測序，分別測得菌株G43和G39的全長DNA序列。菌株G43的序列通過NCBI BLAST比對，與cry1Ca9的相似性最高，為99%，全長3 570 bp，1 189個氨基酸，各種氨基酸的個數及占比見表1。由表1可知，谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）和天冬酰胺（Asn）含量最高，分別為8.07%、7.23%、8.66%和7.15%，該Cry1Ca蛋白分子量為134.48 kD，等電點為pH 4.745，是弱酸性蛋白質。克隆cry1C基因為構建對甜菜夜蛾等害蟲有高活性的工程菌株創造了條件。

2.3 菌株G39中cry1C基因的突變分析

測序發現，突變體和原始菌株的蛋白序列主要在N端發生了一些變化，由測序得到的G39和G43的cry1C基因推導的氨基酸序列比對如下。

比較發現，突變體的氨基酸序列共發生了8個位點的突變。第1至第5位由MEENN突變為-GGKY，第751位由I突變為V，第1 063位由D突變為G，第1 073位由E突變為G。圖4顯示了Cry1Ca蛋白的活性區的3個結構域，包括35-625位氨基酸。突變的位點雖然不在該蛋白的活性區域內，但是由于起始密碼子的缺失，直接導致了該基因編碼的Cry1Ca蛋白不能表達。

3 小結與討論

本研究在分子水平上驗證了菌株在傳代過程中確實會出現自然突變體，也為尋找更好的殺蟲活性蛋白提供了思路和資源。然而由于自然突變的不確定性，基因突變往往導致殺蟲蛋白活性的降低或喪失。本研究通過研究自然突變體活性喪失的原因，進一步明確殺蟲蛋白結構和功能之間的關系[5]，為人工改造殺蟲基因，提高殺蟲活性提供一定的理論依據。

參考文獻：

[1] SCHNEPE E，CRICKMORE N，VAN RIE J，et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J].Microbiol Mol Bio Rev，1998，62（3）：775-806.

[2] 曾曉慧，張宏宇，喻子牛，等.蘇云金芽孢桿菌對甜菜夜蛾幼蟲毒力的生物測定方法[J].中國生物防治，1998，14（4）：172-175.

[3] KUO W S，CHAK K F. Identification of novel cry-type genes from Bacillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymorphism of the PCR-amplified DNA[J].Applied and Environmental Microbiology，1996，62（4）：1369-1377.

[4] 于 群，張 杰，王曉明，等.產熒光假單胞菌分離鑒定及其質粒DNA復制區的克隆[J].農業生物技術學報，2002，10（1）：77-80.

[5] 魏 敏.殺蚊蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白結構與功能研究進展[J].安陽工學院學報，2011，10（6）：19-21.