白芨生肌膏對肛腸病術后創面HSP70基因表達的臨床觀察

楊斌

肛腸直腸病是指肛門直腸有關的一系列疾病[1]，常見的有痔、肛裂、肛瘺等臨床常見病、多發病，其治療方法主要以手術為主，但由于術野易受糞便污染，故手術創面完全開放，以二期愈合的方式愈合。手術創面部位比較特殊，創面愈合難度較大，愈合時間較普通手術切口更長，嚴重影響了患者的生活。目前，對肛腸病術后創面愈合的認識是一種理論的推斷，缺乏有力的研究證據。部分學者研究發現[2]熱休克蛋白70（HSP70）與創面愈合密切相關。HSP70在創面愈合過程中，以綁定抗原肽和轉運到抗原遞呈細胞和T淋巴細胞的方式，形成了免疫應答，進而激發創面皮膚愈合。本院肛腸科白芨生肌膏紗條換藥促進肛腸病術后創面愈合療效顯著，但缺乏有力依據，本研究通過對術后創面組織HSP70表達量的觀察，客觀評價白芨生肌膏的臨床療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者主要來源于本院術后的住院患者，共收集40例。隨機分為治療組（n=20）和對照組（n=20）。治療組中男13例，女7例，年齡19～65歲，平均年齡（54.2±3.7）歲，病程3個月～2年，平均病程（12.6±4.8）個月。痔瘺類型：混合痔6例、肛瘺4例、外痔4例、內痔3例、血栓痔2例、肛裂1例。對照組中男12例，女8例，年齡20～66歲，平均年齡（56.2±4.1）歲，病程3個月～2年，平均病程（13.7±3.6）個月。痔瘺類型：混合痔5例、肛瘺5例、外痔3例、內痔4例、血栓痔2例、肛裂1例。所有患者參照[3]國家中醫藥管理局批準的《中醫肛腸病診斷療效標準》及中華醫學會外科學分會肛腸外科學組制定的《痔診治暫行標準》得到確診。本研究已通過醫院倫理委員會批準。入選患者符合以下標準：①手術切口分類屬于III類（污染）切口；②近5 d內未用過相關外用藥物；③簽署知情同意書，接受研究治療方案。排除以下患者：①伴有糖尿病、惡性腫瘤、貧血、尿毒癥、黃疸及微量元素缺乏癥；②不能堅持治療者，不能判斷療效者；③對藥物成分過敏者。

1.2 治療方法

1.2.1 白芨生肌膏的制作 按方（白芨50 g、生黃芪30 g、川芎10 g、生地榆30 g、五倍子30 g、丹參30 g、血竭10 g）將各藥均勻混合研成細粉。藥粉經過100目篩篩選1次，浸泡在1 000 g芝麻油里放置3 d。將芝麻油用文火加熱，使藥粉呈棕褐色，雙層紗布過濾去除渣質；待油溫降至50～60℃時，摻入蜂膠，全部攪拌均勻，完成白芨生肌膏的制作過程。

1.2.2 治療組 手術后第1天大便后使用白芨生肌膏創面換藥，每次換藥前均常規消毒，用白芨生肌膏制成的紗條填塞創面基底部，每天換藥1次至創面愈合。

1.2.3 對照組 手術后第1天大便后使用馬應龍龍珠軟膏制成的紗條填塞創面基底，每天換藥1次至創面愈合。

1.3 療效指標檢測

1.3.1 取材及病理學觀察 選取術后治療前第1天，治療后第3天及第7天的創面組織標本。取患者術后治療前第1天、術后第3、7天創面口組織，盛入病理學檢測專用epp管中，迅速放入液氮罐內以保持組織DNA內的HSP70的性質，供基因表達量檢測之用。

1.3.2 創面局部HSP70含量和檢測 采用實時熒光定量RT-PCR檢測HSP70編碼基因的表達，HSP70及內參（β-action）所用的引物序列由大連寶生物科技公司設計合成，HSP70上游引物：5’-CGC GAA TTC GAG GTG AAA GAC GTT CTG CTG C-3’；HSP70下游引物：5’-TAG TCG ACT CAA ATG CCG TTG GCG TCG-3’；從液氮中取出已準備好的標本，根據RT-PCR試劑盒、總RNA提取試劑盒說明提取組織中mRNA，然后進行實時熒光定量RT-PCR擴增HSP70。

1.3.3 臨床癥狀評價 對兩組術后創緣水腫消退時間和創面愈合時間進行統計學分析，從而進行療效評價。

1.4 統計學方法 研究中采集的各項數據均用SPSS 17.0統計軟件分析。其中HSP70定量結果作為計量資料內以“x±s”表示，采用t檢驗和Wilcoxon秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因相對定量表達 采用ΔCt方法進行相對定量，來比較目的基因。HSP70目的基因Ct值由實時熒光PCR反應曲線得到，見圖1。

圖1 實時熒光PCR反應曲線Figure 1 Real time fluorescence PCR reaction curve

2.2 兩組患者創面組織HSP70 mRNA表達量比較 肛腸病術后后患者第1天創面組織中HSP70 mRNA表達量兩組比較差異無統計學意義；手術后第3天患者創面組織中HSP70 mRNA表達量比較，治療組比對照組有明顯增加（P＜0.05）；手術后第7天創面組織中HSP70 mRNA表達量比較，治療組比對照組有顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

3 討論

肛腸疾病手術屬于污染切口，一般主張創面二期愈合，術后創面愈合的時間長短不一，受許多因素的影響，術前的準備，手術中的操作，手術方式，術后的護理等都可以影響肛門創面愈合的時間[4-5]。由于肛門區處于軀體最低位，糞便通過的出口，肛周皮膚及皮下組織松弛具有彈性，術后創面難以在短時間內愈合，而且疼痛感明顯。創面愈合的機制目前仍不明確，非常復雜，按愈合的時間段分為炎癥期、纖維增生期、重塑期。根據國內外的研究進展，研究者發現創面愈合與HSP呈正相關性，HSP是一種應激時新合成或合成增多的保護性蛋白，在細胞內具有抗氧化的生物活性，可以增強細胞對損害的耐受程度，幫助線粒體恢復損傷，增加內源性抗氧化劑的合成和釋放，促進創面愈合[6]。所以，我們應該規范術前、術中、術后的操作，盡量減少術后的疼痛、感染、水腫等并發癥，同時提高創面組織對熱休克蛋白的表達，更好地促進創面愈合。油膏劑作為中醫的傳統藥膏劑型，能直接作用于創面，發揮局部的治療作用，尤其適合創面愈合的治療[7]。

從本研究結果表明本方白芨生肌膏能明顯提高創面組織HSP70的表達，對術后創面進行白芨生肌膏局部換藥，檢測治療組第3、7天創面組織中HSP70 mRNA表達量明顯高于對照組，這證實白芨生肌膏創面換藥能誘導機體合成HSP70，促進術后創面組織愈合。白芨生肌膏方中白芨、生地榆、五倍子具有收濕、斂瘡、生肌的功效，丹參、龍血竭具有活血化瘀，加之川芎、生黃芪能促進機體在創傷后合成熱休克蛋白，諸藥合用，共奏活血化瘀、收斂生肌之功，同時油膏制劑對創面保護，創造濕潤環境，促進局部血液循環，誘導創面組織合成HSP70，加快創面修復時間，從而使創面又好、又快地愈合[8]。

綜上所述，白芨生肌膏具有活血化瘀、收斂生肌功效，能增強術后創面組織HSP70表達，加速肛腸疾病手術后創面的愈合。同時該方法安全有效、制作簡單、容易操作、藥簡價廉，在臨床中能更好地推廣。

[1] 陸德銘,陸金根.實用中醫外科學[M].2版.上海:上海科學技術出版社,2010:320.

[2] Li W,Li Y,Guan S,et al.Extracellular heat shock protein-90alpha:linking hypoxia to skin cell motility and wound healing[J].EMB0 J,2007,26(5):1221-1233.

[3] 丁志輝.熱休克蛋白70的胃腸黏膜分子伴侶保護作用及免疫調節功能[J].江西醫學院學報,2009,49(1):136-138.

[4] 國家中醫藥管理局.中醫病證診斷療效標準[M].南京.南京大學出版社,1994:132-133.

[5] 湯毅珊,王寧生.雄黃及雄黃復方對應激蛋白HSP和H0-1的影響[J].中藥藥理與臨床雜志,2008,24(3):48-51.

[6] 楊娥,張恒術.燒傷創面愈合后瘢痕組織成纖維細胞DNA甲基化初步研究[J].中國燒傷創瘍雜志,2015,27(3):219-223.

[7] 張曉芬,孫桂芳,陳亞峰,等.活血化瘀中藥促進創面愈合的研究進展[J].光明中醫,2015(8):1816-1820.

[8] 趙前思,王雄,吳金虎.外用中藥促進燒傷創面愈合機制的研究進展[J].醫學綜述,2014,20(16):3003-3005.