紹興腐乳發酵過程中酶活力和化學組分變化探究

◎ 謝小本

（紹興咸亨食品股份有限公司，浙江 紹興 312000）

在目前我國腐乳生產所應用到的菌種中，紹興腐乳的發酵菌種總狀毛霉品質優良，在腐乳的發酵中十分重要。腐乳是我國民間傳統的美食，其制作流程為讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制。發酵過程看似簡單，但從生物化學的角度而言，腐乳的發酵非常復雜，其中包含了多種酶系的共同作用。在豆腐接種蛋白酶活力很強的根霉或毛霉菌的菌種，其中蛋白質分解成為氨基酸以及其他物質，另外蛋白酶和附著在菌皮上的細菌慢慢滲透豆腐坯內部，分解蛋白質，再經過時間沉淀最后形成腐乳。腐乳制作成功的關鍵就是菌種的選擇，總狀毛霉借助良好的抗雜菌能力以及優良的發酵性能在目前我國腐乳發酵中的應用十分廣泛[1]。為了解腐乳發酵成熟指標、縮短生產周期、提高腐乳品質，本次研究重點分析腐乳在生產過程中的酶活力變化以及組分變化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

總狀毛霉XH-22，紹興咸亨食品股份有限公司選育的生產用菌種。

1.2 實驗試劑、儀器

試劑：酪氨酸、果膠、福林酚試劑、三氯乙酸、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、麥芽糖、蛋白胨、脂肪酸、硫酸鎂和酵母膏。

儀器：HH.B11420-BS型電熱恒溫培養、828型酸度計、紫外分光光度計、高速冷凍離心機、超凈工作臺、生物顯微鏡。

1.3 培養基

黃泔水培養基：黃豆粉30 g、蔗糖3 g、硫酸鎂2 g、磷酸二氫鉀2 g、淀粉4 g補黃泔水至1 000 mL，113℃滅菌30 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 腐乳坯的制備

將實驗所需的豆腐切塊并擺好，使用高壓噴壺接種一定比例的總狀毛霉混合孢子懸液，每3塊豆腐接種1 mL混合孢子懸液，將其置于霉菌培養箱中，調節培養箱的溫度與濕度制得腐乳坯。

1.4.2 腐乳發酵菌液制備

利用6%接種量，將種子培養菌液接種于已經準備好的黃泔水培養基中，溫度控制在28℃，200 r/min振蕩培養48 h。

1.5 觀察指標與測定方法

1.5.1 觀察指標

對酶活力、腐乳前發酵酶活力、腐乳后發酵酶活力、腐乳后發酵化學組分變化進行測定分析。

1.5.2 測定方法

腐乳后發酵化學組分變化：①鹵湯成分以及含量為紹興酒86%、鹽7%、香料1%、味精5%、辣椒面1%。②氯化鈉含量的測定，參照SB/T10170-1993。③粗蛋白的測定，參照GB/T5009.5-2003。④脂肪測定，參照GB/T5009.6-2003。⑤游離脂肪酸的測定，參照GB/T15684-1995。⑥總酸的測定，參照GB/T5009.40-2003。⑦氨基酸態氮的測定，參照SB/T10170-1993。⑧還原糖含量的測定，參照SB/T10213-1994。

1.6 生產工藝

1.6.1 前期培菌

豆腐坯→接種（XH-22）→培養→涼花→搓毛。

1.6.2 后期發酵

腌坯（食鹽）→裹輔料→裝瓶（鹵湯）→封口→后發酵。

2 結果與分析

2.1 總狀毛霉XH-22培養

2.1.1 蛋白酶活力變化

通過分析發現，在發酵房培養條件下，XH-22發酵到30h是菌體產蛋白酶的高峰期，之后活力開始減弱。

2.1.2 粗蛋白的測定

通過研究發現，在18～30 h階段粗蛋白含量下降非常快，30 h菌絲生物量達到高峰值。出現這種情況的原因可能是菌體在生長過程中直接利用培養液中的小分子氮源。

2.2 腐乳發酵酶活力變化

2.2.1 腐乳前發酵

通過分析發現，測定的酶系中，α-淀粉酶、脂肪酶活力在36 h達到最大值之后下降，蛋白酶、α-半乳糖苷酶、谷氨酰胺酶活力在48 h達到最大值隨后下降，糖化酶在30 h、纖維素酶在66 h、果膠酶活力在72 h達到最大值，隨后下降。通過分析發現，雖然不同酶在不同的時間達到最大值，但相同的是豆坯在培養36 h菌絲開始出現老化，如果繼續培養其質量會出現明顯的下降。綜合各方面因素以及酶活力變化情況等結果，本次研究認為豆坯發酵培養最理想的時間是32～34 h。

2.2.2 腐乳后發酵

分析發現，本次研究的蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、α-半乳糖苷酶、纖維素酶、果膠酶發酵時間與酶活力成反比，只有谷氨酰胺酶發酵時間與酶活力成正比。隨著實驗的進行，發現當發酵至45 d，谷氨酰胺酶為86.3 U/g，基本形成了腐乳的風味，該結果可以作為判斷腐乳成熟的一個參考指標。

2.3 腐乳后發酵過程中化學組分的變化

腐乳生產過程中化學組分變化情況見表1，①腐乳生產過程中，化學組分中的粗蛋白、粗脂肪以及還原糖的含量與發酵時間成反比，這種情況的出現可能與發酵過程中產生的蛋白酶、脂肪酶、糖化酶會將粗蛋白、脂肪、還原糖分解有關。②氨基態氮、游離脂肪酸和總酸的含量和發酵時間成正比。游離脂肪酸是脂肪水解后得到的產物，大豆蛋白質講解的最終產物是游離氨基酸，而游離氨基酸含量的高低直接關系到腐乳鮮味。在腐乳發酵的過程中，由于腐乳前發酵階段微生物分泌的脂肪酶會講解豆坯中的粗脂肪，最終增加游離脂肪酸的含量。③腐乳的酸度是有機酸、游離氨基酸、脂肪酸共同作用的結果，特別是在發酵60 d后酸度出現明顯性的一個增加，表明在發酵的后期有更多的酸性物質生成。④腐乳發酵過程中的鹽分含量變化并不明顯。

表1 腐乳生產過程中化學組分變化情況表

3 討論

在豆腐的基礎上通過利用微生物進行發酵得到的大豆制品腐乳，因具有良好的感官性能且營養豐富，不僅深受國內廣大群眾的喜歡，甚至已進入到其他國家的餐桌。以紹興腐乳生產為例，2016年紹興出口腐乳1 233 t，金額286.1萬美元，數量和金額同比分別增長11.6%和11.3%，主要市場是中國香港地區，其次是東南亞、北美及歐盟。

面對不斷增加的市場需求，實現腐乳的工業化生產成為滿足其市場需求的主要方式。目前，工業生產腐乳主要采用的菌種為毛霉菌屬和根霉菌屬。不同地區的腐乳在口感、感官性質等方面都有一定差異，這與采用不同菌屬以及微生物在發酵過程中產生的不同酶有較大關聯。腐乳的生產過程實際上是一系列的生化變化——蛋白酶將豆腐中的蛋白質分解成多肽、氨基酸等小分子化合物。目前，食品研究相關報道顯示，28 ℃、200 r/min搖瓶條件下雅致放射毛霉在黃豆粉為原料的培養基中生長良好。正常情況下，在前期培菌的過程中，菌絲體會大量積累，到36～40 h逐漸穩定。目前對總狀毛霉并沒有相關的研究報道，本次研究重點分析腐乳發酵過程中酶活力以及化學組分的變化情況，通過分析發現與，雖然搖瓶發酵與發酵房發酵的最佳培養時間不同，但通過對蛋白酶活力、粗蛋白的測定可以發現，發酵30 h與搖瓶發酵36 h生長情況是一致的。出現這種結果的原因可能是發酵的轉速以及溶氧量較大，通過采用擴大培養的方式能夠將發酵周期的時間提前，進一步可以認為通過對總狀毛霉的深層培養可以取代現有的腐乳生產方式，進而達到發酵周期短、菌種純度高、生產效率提高的效果。

另外，為確保腐乳風味以及感官效果，可以考慮采用多種酶系協同發酵的方式，本次研究通過利用XH-22對酶活力進行測定發現XH-22在豆坯上發酵的最佳時間是32～34 h。考慮從化學組分角度進行分析發現，通過對腐乳前期培養、后期發酵過程中進行酶活力以及化學組分的變化分析，發現谷氨酰胺酶≥86.3 U/g、總酸≤1.3%、游離氨基態氮≥0.35%、還原糖≤1.1%及黏度≤2×105mPa·s時可以作為判斷腐乳成熟的參考標準之一。

[1]解春芝，曾海英，宋 杰，等.不同種類腐乳游離脂肪酸組成分析及營養評價[J].中國釀造，2018（2）：39-44.

[2]袁華偉，易小妹，楊粟平，等.湯料成分對白方腐乳保質的影響[J].食品研究與開發，2018，39（5）：100-106.

[3]喻世哲，范 熠，韓北忠，等.低鹽腐乳生產過程及加工環境中的微生物分析[J].中國釀造，2017，36（12）：18-22.

[4]盛明健，周華林，邢利民，等.玫瑰腐乳發酵用紅曲菌種的篩選和應用研究[J].江蘇調味副食品，2017（4）：19-23.

[5]程教擘，謝艷華，劉 金，等.傳統發酵豆制品生產過程中的安全隱患及改進措施[J].食品安全質量檢測學報，2017，8（8）：3092-3098.