論樣品與標準品體系的差異對實驗結果的影響

◎ 劉 猛

（遼寧省產品質量監督檢驗院，遼寧 沈陽 110144）

溶劑效應是指當樣品中某些組分在溶解溶劑與流動相中存在的差異較大導致的色譜行為異常的情況，因此在用液相色譜檢測時，通常會選擇初始比例的流動相來溶解樣品，其目的是避免溶劑效應引起的峰型變差帶來的定量不準確等后果，這一點對于大多數樣品非常適用。但定量是以定性為前提的，因此除了溶劑體系的差異所引起的溶劑效應外，樣品本身與標準品的pH值的差異在定性時帶來的影響也是不容忽視的。本文描述了在使用高效液相色譜儀檢測市售濃縮冷面湯中安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉時，如何解決樣品中目標物保留時間漂移引起的無法準確定性，進而無法出具定量報告的問題。

1 材料及方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

美國PerkinElmer公司Altus A-30 超高效液相色譜儀，配有PDA檢測器，柱溫箱，自動進樣器和Empower軟件；色譜柱：C182.1 mm×50 mm，1.7 μm；Eppendorf移液槍；pH計，梅特勒。

1.1.2 試劑

甲醇：色譜純，Fisher公司；乙酸銨：色譜純，TCI公司；超純水：密理博；安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉標準品：1.0 mg/mL，國家標準物質研究中心GBW；25%氨水：優級純，Merck。

1.1.3 標準溶液配制

用純水配制含苯甲酸、山梨酸、糖精鈉安賽蜜濃度為1 μg/mL的混合標準溶液。

1.1.4 實際樣品

市售袋裝濃縮冷面湯。實驗中，樣品加標終濃度均為 1 μg/mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 儀器方法

流動相A：甲醇，流動相B：20 mmol/L乙酸銨，按A∶B=5∶95比例等度洗脫[1]；柱流速0.45 mL/min；進樣量10 μL；柱溫，室溫；PDA檢測波長230 nm[1]，采樣頻率20 point/s。

1.2.2 樣品處理

冷面湯樣品用純水稀釋10倍上機檢測。

2 結果與討論

2.1 實驗中出現的問題

用1.2.1方法進行檢測，標準品峰型及分離效果均正常，如圖1所示，按出峰前后順序，分別為安賽蜜、苯甲酸、山梨酸和糖精鈉。

圖1 四種標準品色譜圖

上機檢測1.2.2得到的實際樣品，結果如圖2所示。圖2中，上方的線為冷面湯樣品，下方的線為用1.2.1中流動相配制的混標，將標準品與實際樣品譜圖進行了對比，通過保留時間判斷，初步判定冷面湯樣品中沒有待測的4種添加劑。為了進一步驗證結果，向冷面湯中添加標樣后再上機檢測，結果如圖3所示。

圖2 實際樣品與標準品對比圖

圖3 實際樣品與樣品加標對比圖

圖3中，上方的線為樣品，下方的線為加標樣品，在冷面湯樣品中山梨酸和糖精鈉，由標準體系中的2.5 min后出峰，提前到2.4 min前出峰，并且兩個峰分離度變差，達不到基線分離。在對比了冷面湯樣品和樣品加標后的譜圖不難發現，在實際樣品中是存在糖精鈉的。但由于糖精鈉在標準品和冷面湯樣品中出峰時間相差較大，無法通過軟件定量分析。因此糖精鈉在不同體系中保留時間匹配不上及其與山梨酸分不開的問題亟待解決。

2.2 解決措施

首先在檢測冷面湯樣品時調整了儀器檢測條件，如降低柱流速、更改檢測波長、采樣頻率、降低甲醇比例至2%，這些條件的更改對于樣品中山梨酸和糖精鈉的分離沒有起到改善作用。由此分析，在檢測實際樣品才會出現問題，初步判斷是樣品自身和標準品的差異過大所導致，接下來測量樣品和配制好的標準品溶液pH值。結果顯示，標準品溶液pH值為6.7，而冷面湯樣品的pH值僅為2.8。為了確認是pH值引起的樣品中目標峰漂移，對制樣的過程嘗試調整。

在稀釋樣品前，先用氨水調節樣品pH值至6.7±0.1，調整流動相比例為甲醇∶乙酸銨（7∶93，V/V）將樣品稀釋10倍[2]，最后加標上機檢測。但1.2.1中的等度洗脫條件仍然無法將山梨酸和糖精鈉分離開，于是又嘗試用梯度洗脫進行分離。經過優化，最終確定儀器條件為柱流速0.2 mL/min，進樣量2 μL；柱溫，室溫；PDA檢測波長230 nm，采樣頻率20 point/s，梯度洗脫條件表見表1。

表1 梯度洗脫條件表

經過優化后，加標樣品中的山梨酸和糖精鈉可以達到基線分離，見圖4。將加標的樣品和未加標樣品、以及流動相配制的標準品進行比較，4種目標物在任何體系中保留時間都未漂移（見圖5），可以定性定量分析。

圖4 優化后的樣品加標色譜圖

圖5 對比圖

3 結論

通過實驗可以看出，溶劑效應不僅僅局限于目標物在不同溶劑體系中溶解度不同引起的峰型變差，還體現在酸堿度不同引起的目標物電離狀態的不同而引起的峰漂移。因此，對于液相色譜分析而言，保留時間的匹配是準確定量的前提，盡可能地保證樣品稀釋劑體系與流動相體系相同，才能避免溶劑效應所引起的各種色譜行為異常的現象，為準確定量提供保障。

[1]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.GB 5009.28-2016 食品安全國家標準食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定[S].北京：中國標準出版社，2017.

[2]劉 麗，彭名軍，鄭志偉，等.UPLC法同時測定食品中5種添加劑[J].現代預防醫學，2010，37（12）：2318-2319.