檢測莠去津殘留試劑盒的研制

◎ 扶 勝，羅維超，袁學偉，周 艷，鄧小霞

（貴州勤邦食品安全科學技術有限公司，貴州 貴陽 550009）

莠去津是目前世界上使用范圍最廣、使用量最大的選擇性內吸前導型苗前、苗后除草劑，主要用于玉米和高粱等糧食作物以及果園和林地等的除草[1]。莠去津具有毒性，易通過食物進入人體，對人體的神經系統、免疫系統、生殖系統具有毒性以及遺傳毒性[2]，目前被列為國際環境優先控制污染物[3-4]。而在農產品的進出口貿易、食品和環境安全的監督檢測中出現的檢測技術性空缺，嚴重影響了我國農產品的出口[5]。因此，研發一種適合于大批量農產品的現場快速檢測的產品具有及其重要的意義。

目前，莠去津殘留的檢測方法有氣相色譜法（GC）[6]、氣相色譜-質譜串聯用法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）和分子印跡技術等，這些技術方法檢測靈敏度高、特異性強，但是比較耗時，過程較為繁瑣，主要是樣品前處理步驟需要大量的時間，同時儀器檢測方法所需的大型儀器和設備耗資巨大，對實驗操作人員的專業程度要求較高，無法實現現場大規模樣品的快速檢測。

與之相比，酶聯免疫方法也具有特異性好、靈敏度高的特點，同時酶聯免疫分析方法還具有操作簡便、檢測成本低、檢測用時較短、對實驗人員的專業程度無特殊要求等特點，適合于批量樣品的篩選檢測，普通人員只需稍微培訓即可上手進行操作檢測，能夠滿足各階層人員以及企業或相關部門對食品安全快速檢測。目前，在ELISA分析領域有不少的報道，王彩虹等通過合成人工抗原并制備出單克隆抗體的研究該方法建立的間接ELISA檢測莠去津的方法，最低檢測限量達到了ng級，奠定了食品中莠去津殘留檢測的基礎；生威等建立了一種快速檢測玉米中莠去津殘留的酶聯免疫分析方法；Barchanska等應用酶聯免疫方法對奶中莠去津殘留進行了監測。目前，尚未有關于該方法應用于莠去津在甜料甘蔗中殘留的檢測相關報道，因此，本研究相關的成果可為莠去津在食品中的殘留快速檢測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性Balb/c小鼠（6～8周齡），北京勤邦生物技術有限公司；莠去津標準品（純度≥99%）、牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、氫氧化鈉、三聚氯氰，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-氨基丁酸，上海麥克林生化科技有限公司；異丙胺，百靈威科技有限公司產品。

1.2 儀器與設備

勻質機，上海茸研儀器有限公司；電子天平，永康市龍蓓工貿有限公司；XH-C漩渦混合器，金壇區金城海瀾儀器制造廠；TDL-5000-CR低速離心機，上海圣科儀器設備有限公司；微量移液器（單道20～200 μL、100～1 000 μL，多道20～300 μL），上海力辰儀器科技有限公司；SPX-250生化培養箱，上海合呈儀器制造有限公司；酶標儀，北京線上生物科技有限公司；磁力攪拌器，鞏義予華儀器有限公司；溫度計、四口瓶、恒壓滴液漏斗、抽濾瓶、抽濾漏斗，上海禾汽玻璃儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 莠去津半抗原的合成

合成路線如圖1所示。在四口瓶中加入水、異丙胺，插入溫度計，冰水浴冷卻反應混合物至0～5 ℃，緩慢滴加三聚氯氰，當三聚氯氰剩下一半時開始滴加30%的氫氧化鈉水溶液，滴加的速度和滴加三聚氯氰的速度保持一致，直到所有原料全部滴加完成，保持0～5 ℃反應40 min，反應中，在另一個四口瓶中加入4-氨基丁酸和水，控制該溶液溫度在20～25 ℃，開始滴加反應完全的異丙胺和三聚氯氰的反應液，當加入一半時，開始滴加30%氫氧化鈉水溶液，滴加的速度和反應液滴加的速度保持一致，直到所有原料全部滴加完畢。保持溫度反應40 min。反應瓶底部產生大量白色固體，過濾該固體，洗滌至中性，空氣中干燥后，加入100 mL的正己烷中，攪拌過夜，次日進行過濾，用正己烷沖洗濾餅3次，每次20 mL，得到的固體再空氣中干燥后即為目標產物。各原料和三聚氯氰的摩爾比均為1∶1。

圖1 莠去津半抗原的合成路線圖

1.3.2 人工抗原的制備

（1）免疫的原制備。將45 mg莠去津半抗原溶于1 mL DMF中，加入70 mg NHS和70 mg EDC，室溫反應30 min后，緩慢滴加4 mL BSA的PB溶液，滴畢，室溫攪拌過夜。次日將反應液離心，收集上清液。隨后用0.02 mol/L PB緩沖液將偶聯所得免疫原透析3天，每天早晚更換透析液，以除去未反應的小分子物質。即得莠去津免疫原，分裝，于-20 ℃保存備用。

（2）莠去津包被原制備。稱取45 mg莠去津半抗原溶解于1 mL DMF溶液中，分別加入100 mg EDC和100 mg NHS活化，30 min后將其加入到150 mg載體蛋白OVA（溶于5 mL PB緩沖液中）室溫攪拌過夜。次日將反應液離心，取上清液，4℃的條件下，用0.02 mol/L PB緩沖液透析3天，每天更換透析液兩次后分裝，-20 ℃冰箱中保存備用。

1.3.3 莠去津單克隆抗體制備

按照文獻的方法制備腹水單克隆抗體，每只小鼠的免疫劑量為200 μg。抗體的純化采用飽和硫酸銨法。

1.3.4 抗原抗體最佳工作濃度的確定

將莠去津的包被抗原和單克隆抗體溶液進行倍比稀釋，進行間接競爭ELISA方陣試驗，分別選取OD450最接近1.0的濃度作為最佳工作濃度。

1.3.5 間接競爭ELISA方法的建立

用相應的抗原緩沖液將包被抗原稀釋成10 μg/mL，100 μL/孔包被在96孔酶標板上，37 ℃避光孵育2 h；在4 ℃冰箱中保存過夜，次日棄去孔中包被液，用洗滌液洗滌1次，拍干，150 μL/孔加入封閉液，37℃保存2 h；直接拍干，加入一系列濃度呈現梯度的莠去津高標溶液，50 μL/孔，加畢，加入經抗體稀釋液稀釋成最佳工作濃度的抗體溶液，50 μL/孔，然后25 ℃避光反應30 min；洗滌4～5次后，拍干，加入酶標二抗，100 μL/孔，25 ℃避光反應30 min后用洗滌液洗滌4～5次，拍干，先加入底物液A液（過氧化脲）再加入B液（四甲基聯苯胺），各50 μL/孔，25 ℃保存15 min后加入2 mol/L H2SO4水溶液，孔內液體由藍色變成黃色，將酶標儀設定波長為450 nm，測定每孔吸光度值（OD值）。并用RIDASCREEN軟件進行數據處理。

1.3.6 標準曲線的繪制

采用間接競爭ELISA方法建立標準曲線，分別選擇標準品濃度0、3、9、27、81 ng/mL和243 ng/mL，以濃度為0 ng/mL時的OD值為B0值，相應莠去津濃度的OD值為B值，以百分吸光度值（B/B0）為縱坐標，標準品濃度的對數值為橫坐標，采用RIDASCREEN軟件繪制標準曲線并打印成紙質文檔進行實驗結果的觀察。

1.3.7 甘蔗和玉米的樣本前處理

用10 mL的離心管稱取勻質后的玉米和甘蔗樣品，玉米和甘蔗分別稱取兩管，每一管中樣品的質量為1 g，然后將其中一管玉米樣品和一管甘蔗樣品進行加標，加標量為10 μg，然后每一管中加入2 mL甲醇，用渦旋儀渦動1 min將樣品混勻；室溫4 500 r/min離心5 min后取上清液200μL，加入到含有800 μL復溶液的樣品管中混勻進行用于ELISA分析。確定甲醇作為提取劑的提取效果。

1.3.8 確立試劑盒各項技術參數

（1）試劑盒檢測限確立試驗。用20個空白樣本通過試劑盒測定的光密度在標準曲線上對應的莠去津濃度的平均值（X）和標準差（S）來表示為MDL=X+3S。

（2）試劑盒準確度和精密度確立試驗。分別用5、10、15μg/kg三個不同濃度的莠去津標準品作空白玉米和甘蔗樣本的添加回收試驗，計算其回收率和變異系數，分別表示如下：

式中，Cx為添加了一定莠去津含量的樣本經過標準曲線分析得到的實際濃度，μg/kg；C0為空白樣本經過標準曲線分析得到的實際濃度，μg/kg；C為實際添加的莠去津濃度，μg/kg。

（3）試劑盒穩定性試驗。將一定量的試劑盒保存于4℃環境中，每隔1個月取出適量，分別測定其空白標準品的OD值、IC50，及按上述方法進行添加回收試驗所測得的回收率以及變異系數，根據試驗結果判斷試劑盒的穩定性；考慮到試劑盒在運輸和使用過程中可能會有非正常保存條件出現，將試劑盒保存在37 ℃條件下，每隔1天取出進行測定，直到試劑盒的靈敏度和回收率開始下降為止停止檢測。一般情況下，在37℃穩定1天，相當于4～10 ℃保存45天。由此確定其保質期。

（4）可靠性試驗。各隨機抽取玉米和甘蔗樣品20份，用本試劑盒方法與國家標準中標準方法中氣相色譜法（對水果、蔬菜、谷物中莠去津的最低檢測濃度為4 μg/kg）分別對其進行測定，根據兩種檢測方法的實驗結果進行比較，驗證試劑盒檢測實際樣本的準確度。

2 結果與分析

2.1 最佳工作濃度的選擇

運用方陣法測定不同包被原和單克隆抗體的間接競爭抑制ELISA測定結果（OD450值），見表1。在ELISA包被過程中，包被效果與濃度呈正相關，但濃度過高，會降低待測物的競爭能力，從而降低曲線靈敏度。因為酶標儀測定OD450值的敏感范圍在1.00左右，為了保證測定結果的靈敏可靠，根據表中的結果，確定實驗的最適包被原稀釋倍數為13.5×104，最佳抗體稀釋倍數為1∶125 000。

表1 不同包被原和單克隆抗體稀釋濃度的OD450值表

2.2 標準曲線的建立

根據建立的間接競爭ELISA方法，將莠去津標準品濃度稀釋為0、3、9、27、81 ng/mL和243 ng/mL，用上文所確定的抗體稀釋倍數稀釋抗體，用酶標儀進行檢測，其中0和3 ng/mL點雙孔，其余的濃度點單孔，采用二步法進行檢測，得出相關系數 R2=0.9955，IC50為18 μg/L。標準曲線如圖2所示。

圖2 莠去津的檢測標準曲線圖

2.3 試劑盒各項技術參數的確定

2.3.1 試劑盒檢測限試驗

由表2可知，該試劑盒方法對玉米和甘蔗樣本的檢測下限分別為 24.60 μg/kg、26.30 μg/kg。

表2 莠去津試劑盒方法檢測限表

2.3.2 準確度和精密度試驗

分別以回收率和變異系數表示試劑盒測定的準確度以及檢測精密度。分別設置空白玉米和甘蔗樣本，以50、100、150μg/kg 3個添加濃度做添加回收實驗，每個濃度做4個平行，用3個批次的試劑盒進行測定，分別計算回收率和批內、批間變異系數，結果見表3。

表3 莠去津試劑盒的準確度和精密度表

由表3可知，以3個不同濃度的莠去津標準品對空白玉米和甘蔗樣本進行添加時，其加標回收率范圍為88.5%～106.4%，批內變異系數范圍為5.0%～7.3%，批間變異系數范圍為6.9%～8.8%，均小于10%，以上結果說明，該試劑盒的各項參數均符合要求。

2.3.3 穩定性試驗

試劑盒在2～8 ℃的保存條件下，經過12個月的測定，其最大吸光度值（零標準）、抑制中濃度、莠去津添加回收實驗測定值均在正常范圍之內。在各種非正常保存條件中，測定結果也沒有異常。從以上可知試劑盒可以在2～8 ℃至少保存12個月以上。

2.3.4 可靠性試驗

通過ELISA試劑盒法和氣相色譜法對隨機抽取的玉米、甘蔗樣本進行測定。玉米和甘蔗樣本的陽性判定線為27 μg/kg，結果篩選出1份陽性玉米樣本和3份陽性甘蔗樣本，兩種方法的比較結果見表4。

表4 ELISA法和GC法檢測結果比較表

由表4可知，用ELISA法和GC法的測定結果基本一致，適用于玉米和甘蔗中莠去津殘留的篩選。

3 結論

本研究通過全合成法制備出莠去津小分子半抗原，該半抗原與載體蛋白偶聯合成的人工抗原經動物免疫獲得單克隆抗體。經篩選純化后，初步建立了莠去津酶聯免疫試劑盒檢測方法。該方法的靈敏度為3 μg/L，對玉米和甘蔗樣本的最低檢測限為27 μg/kg，樣本添加回收率范圍為88.5%～106.4%，批間/批內變異系數為均低于10%。本研究所得結果在其檢測限范圍內，因此可用于相關行業的莠去津殘留快速檢測。此外，本實驗所研制的試劑盒的使用可最大限度地節約時間成本和經濟成本，對檢測人員的要求較低，適用于大量樣本中莠去津殘留量檢測的快速篩選，可更好地應用于我國基層檢測單位、政府職能監管部門等開展的檢測工作，是一種可靠的莠去津農藥殘留的快速檢測方法。

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