核酸雜交檢測(cè)在細(xì)菌性陰道病及外陰陰道假絲酵母菌病診斷中的應(yīng)用價(jià)值

李田 李小毛 丁杰 黃敏 禹夜

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院（廣州 510630）

陰道炎是婦產(chǎn)科常見病之一，最常見的是細(xì)菌性陰道病（bacterial vaginosis，BV）和外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）。兩種疾病的發(fā)生均與陰道微生態(tài)平衡破壞相關(guān)。細(xì)菌性陰道病時(shí)，陰道內(nèi)的乳酸桿菌減少，導(dǎo)致其他微生物大量繁殖，主要有加德納菌、厭氧菌（動(dòng)彎桿菌、普雷沃菌、紫單胞菌、類桿菌、消化鏈球菌等）以及人型支原體，其中以厭氧菌居多［1-2］。Nugent評(píng)分法診斷細(xì)菌性陰道病在靈敏性、特異性、客觀性及可重復(fù)性方面均相對(duì)較好，但因革蘭染色自身技術(shù)的局限性，對(duì)工作人員自身素質(zhì)要求高，使其在臨床應(yīng)用受限。Amsel法是臨床常用檢查方法之一，但由于主觀因素強(qiáng)、需要人為的工作較多，越來越多的醫(yī)生開始使用快速診斷試劑，例如BV藍(lán)試劑，主要通過酶法間接診斷。外陰陰道假絲酵母菌病是第二種常見的陰道炎，真菌涂片鏡檢和真菌培養(yǎng)法是真菌學(xué)檢驗(yàn)的基本方法，由于真菌培養(yǎng)可提高病原體的檢出率、鑒定菌種和進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，故其目前仍是診斷真菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”［3］。但培養(yǎng)法耗時(shí)，不宜做為門診常規(guī)檢查。近年來分子診斷廣泛應(yīng)用，與傳統(tǒng)檢測(cè)比較，分子診斷在陰道炎診斷中的優(yōu)勢(shì)明顯［4］。AffirmTMVPIII是一種通過DNA探針技術(shù)，以核酸雜交原理為基礎(chǔ)，對(duì)臨床具有陰道炎或陰道病癥狀患者的分泌物進(jìn)行檢測(cè)和識(shí)別陰道加德納菌屬，念珠菌屬和滴蟲的核酸的試劑。該檢測(cè)方法于2015年美國(guó)CDC［3］推薦使用，但國(guó)內(nèi)應(yīng)用少，本文將傳統(tǒng)的陰道炎檢測(cè)方法與之比較，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年8月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科門診具有陰道炎癥狀或體征的女性患者共103例。所有患者檢測(cè)時(shí)均排除月經(jīng)、妊娠、24 h內(nèi)有性生活，72 h內(nèi)有陰道沖洗以及1周內(nèi)受過抗真菌、抗加德納菌、抗滴蟲的治療。

1.2 標(biāo)本采集在樣本采集試管上貼上患者識(shí)別信息標(biāo)簽，標(biāo)注樣本采集時(shí)間。以盆腔檢查體位安置患者，插入陰道窺器，以便能夠看到陰道后穹窿。使用無菌棉簽從陰道后穹窿采集標(biāo)本，將棉簽在陰道壁上轉(zhuǎn)動(dòng)或滾動(dòng)2～3次，確保棉簽的整個(gè)外周都已經(jīng)接觸過陰道壁。對(duì)于每個(gè)測(cè)試者，共使用4根無菌拭子分別從每位患者陰道后穹隆左右兩側(cè)取樣。第1個(gè)取樣拭子放入Affirm樣本收集管中，室溫下保存1 h之內(nèi)進(jìn)行測(cè)試。樣本管加入裂解溶液之后，85℃裂解10 min，再加入緩沖溶液。將處理好的樣本溶液轉(zhuǎn)移入反應(yīng)槽中，再在相應(yīng)的孔位中加上底物溶液和探針分析卡（PAC），反應(yīng)槽裝入儀器進(jìn)行自動(dòng)運(yùn)行。檢測(cè)完成把PAC從儀器上取下進(jìn)行結(jié)果判讀。第2個(gè)取樣拭子存放在無菌試管中，加入稀釋液，然后把該拭子滾動(dòng)涂布于2張玻片，一張用于用于線索細(xì)胞、真菌孢子和假菌絲的觀察，一張用于Nugent評(píng)分。第3個(gè)取樣拭子進(jìn)行BV藍(lán)試劑檢測(cè)。第4個(gè)取樣拭子行真菌顯色培養(yǎng)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 AffirmTMVPIII（由 Becton，Dickinson and Company提供）分析卡PACs陰性對(duì)照為無色，陽性對(duì)照為藍(lán)色，則3種微生物的微球上顯示藍(lán)色為陽性，無色為陰性。

1.3.2 生理鹽水涂片由固定的高年資檢驗(yàn)師進(jìn)行檢查，顯微鏡下觀察線索細(xì)胞、真菌孢子和假菌絲，以及滴蟲。

1.3.3 Nugent評(píng)分使用珠海貝索生物技術(shù)有限公司的快速革蘭氏染色液（Rapid Gram Stain），檢驗(yàn)方法：標(biāo)本薄而均勻地涂在玻片上，加龍膽紫液染色10 s，之后水洗，甩干；加碘溶液染色10 s，之后水洗，甩干；加脫色液脫色10～20 s，之后水洗，甩干；最后加沙黃溶液復(fù)染10s，之后水洗干燥。Nugent評(píng)分0～3分，為正常；4～6分，診斷中間型BV；≥7分，診斷BV。

1.3.4 BV藍(lán)檢測(cè)（愛必維試劑盒，由北京中生金域公司提供）把受試者的陰道分泌物置入試管內(nèi)，在試管中滴入黃色稀釋液6～18滴，在反應(yīng)裝置的5個(gè)孔內(nèi)的每個(gè)孔中加入經(jīng)處理過的樣品1滴，當(dāng)內(nèi)容物超過反應(yīng)孔的一半為最適宜位置，隨后把“顯色液A”滴入“唾液酸苷酶”反應(yīng)孔內(nèi)，大約1滴。把反應(yīng)裝置置入溫度為37℃的水浴箱，顯色后對(duì)其結(jié)果進(jìn)行記錄。

1.3.5 真菌培養(yǎng)采用真菌顯色（真菌顯色平板由江門市凱林貿(mào)易有限公司提供）培養(yǎng)法，把陰道分泌物標(biāo)本接種于顯色培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)48 h后，有菌落生長(zhǎng)為陽性，未培養(yǎng)出菌落為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以Nungent評(píng)分和真菌培養(yǎng)法作為細(xì)菌性陰道病及外陰陰道假絲酵母菌病的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算AffirmTMVPIII及常用檢驗(yàn)方法（濕片鏡檢，BV藍(lán)試劑）與金標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)比較的敏感性及特異性。采用Kappa檢驗(yàn)分別計(jì)算AffirmTMVPIII的檢測(cè)結(jié)果與常用檢驗(yàn)方法（濕片鏡檢，BV藍(lán)試劑）的一致性。Kappa＞0，此時(shí)說明有意義，Kappa愈大，說明一致性愈好；Kappa≥0.75時(shí)，兩者一致性較好，0.4≤Kappa＜0.75時(shí)，兩者一致性一般；Kappa＜0.4時(shí)，兩者一致性差。

2 結(jié)果

2.1 樣本檢測(cè)分布本次實(shí)驗(yàn)共采集103例有效標(biāo)本評(píng)價(jià)AffirmTMVPIII檢測(cè)方法的應(yīng)用價(jià)值。入組人群中各種感染的比例（金標(biāo)準(zhǔn)方法）見表1、2，BV占48.5%，VVC占38.8%，其中混合感染總共有24例，占有效樣本的23.3%。AffirmTMVPIII檢測(cè)對(duì)混合感染的檢出準(zhǔn)確率為83.3%，濕片鏡檢的準(zhǔn)確率為70.3%。

表1 不同檢測(cè)方法的細(xì)菌性陰道病及外陰陰道假絲酵母菌病陽性率分布Tab.1 Distribution of positive rates of BV and VVC in different detection methods 例（%）

2.2 AffirmTMVPIII及常用檢測(cè)方法與金標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比針對(duì)細(xì)菌性陰道病，以Nugent評(píng)分結(jié)合臨床癥狀為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比AffirmTMVPIII和濕片鏡檢、BV藍(lán)試劑的檢出一致性。AffirmTMVPIII檢測(cè)的靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性最高，BV藍(lán)試劑檢測(cè)的準(zhǔn)確性最低。見表3、4。

表2 入組人群各種感染的具體分布Tab.2 Specific distribution of various viginitis in the group

表3 細(xì)菌性陰道病各種診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)方法的對(duì)比Tab.3 Comparison of various diagnostic methods and gold standard methods of BV 例

表4 細(xì)菌性陰道病各種診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性Tab.4 Sensitivity，specificity and accuracy of various diagnostic methods compared with gold standard methods of BV%

針對(duì)外陰陰道念珠菌病，以真菌培養(yǎng)結(jié)合臨床癥狀為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比AffirmTMVPIII和濕片鏡檢的檢出率（表5、6），Affirm與鏡檢方法的靈敏性、特異性和準(zhǔn)確性均較高。所有的念珠菌感染中，白色念珠菌占92.1%，非白色念珠菌占7.9%。

表5 外陰陰道念珠菌病各種診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)方法的對(duì)比Tab.5 Comparison of various diagnostic methods and gold standard methods of VVC 例

表6 外陰陰道念珠菌病各種診斷方法與金標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)比的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性Tab.6 Sensitivity,specificity and accuracy of various diagnostic methods compared with gold standard methods of VVC %

3 討論

本研究中門診擬診陰道炎的患者中，BV占48.5%，VVC占38.8%，其中混合感染總共有24例，占有效樣本的23.3%，4例為滴蟲性陰道炎與細(xì)菌性陰道病混合感染，細(xì)菌性陰道病的發(fā)生率最高，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［5-6］。BV是以加德納菌為主的一種混合感染，是陰道分泌物或惡臭的最普遍的原因。然而，調(diào)查顯示，大多數(shù)BV患者無癥狀。研究［7-8］表明，BV可能是由大量具有促炎癥特征的細(xì)菌引起的，宿主免疫功能異常所導(dǎo)致的免疫反應(yīng)。合并BV的婦女其婦科術(shù)后并發(fā)癥、妊娠合并癥［9-10］風(fēng)險(xiǎn)增加，感染其他性傳播疾?。⊿TD）如人免疫缺陷病毒（HIV）、淋病奈瑟菌、沙眼衣原體和單純皰疹病毒Ⅱ型（HSV-2）等風(fēng)險(xiǎn)增大［11］。提高BV的診斷水平，可使疾病得到及時(shí)的控制。對(duì)于BV的實(shí)驗(yàn)室診斷，本研究以Nugent評(píng)分法為金標(biāo)準(zhǔn)，AffirmTMVPIII檢測(cè)的一致性最高，Kappa系數(shù)高達(dá)0.94，多項(xiàng)研究結(jié)果也顯示AffirmTMVPIII的診斷更加客觀和靈敏［12-13］，這一點(diǎn)也在本試驗(yàn)數(shù)據(jù)中得到了反映。2015年美國(guó)CDC［3］推薦AffirmTMVPIII可用于診斷BV。

AffirmTMVPIII核酸雜交法可準(zhǔn)確識(shí)別有BV臨床診斷意義的加德納菌（濃度≥2×105CFU/mL陰道液）。BV藍(lán)試劑是通過檢測(cè)唾液酸苷酶活性來診斷BV，陰道微生態(tài)菌群中，普雷沃菌和擬桿菌是唾液酸苷酶活性增加的主要病原菌，部分加德納菌有此酶活性，而動(dòng)彎桿菌、消化球菌以及人型支原體的此酶活性基本不能檢出。BV是多種厭氧細(xì)菌增多引起的，單純依靠檢測(cè)分泌物中唾液酸苷酶的活性，必然會(huì)導(dǎo)致漏檢由唾液酸苷酶活性低的厭氧細(xì)菌增多引起的BV［14］。而AffirmTMVPIII可以檢測(cè)出一定濃度的普雷沃菌、擬桿菌、動(dòng)彎桿菌和支原體，漏診的幾率較單純唾液酸苷酶檢測(cè)小。

VVC是第二常見陰道感染性疾病，真菌培養(yǎng)法是金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)法耗時(shí)較長(zhǎng)，不能快速獲得培養(yǎng)結(jié)果。臨床上濕片和涂片鏡檢是主要的檢查方法。本研究以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比AffirmTMVPIII和濕片的檢出率，兩者與金標(biāo)準(zhǔn)比較的一致性都較好，Kappa系數(shù)分別為0.91和0.94。鏡檢方法容易受樣本中干擾物質(zhì)影響，觀察者的經(jīng)驗(yàn)以及細(xì)心檢查很重要。本研究中的鏡檢由高年資檢驗(yàn)師完成，與培養(yǎng)法比較，一致性高。AffirmTMVPIII可識(shí)別白色、光滑、熱帶、克柔、克菲、近平滑6種念珠菌，同樣可以達(dá)到與培養(yǎng)法比較一致率高的檢測(cè)水平，在大樣本檢測(cè)且人力不足的情況下可以替代鏡檢，檢測(cè)客觀敏感。

對(duì)于滴蟲性陰道炎的診斷，本研究病例數(shù)不多，常用的濕片法檢測(cè)敏感性低（51%～65%），在分子檢測(cè)方法出現(xiàn)以前培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)診斷方法，目前分子檢測(cè)在滴蟲的診斷中得到肯定，AffirmTMVPIII已被FDA批準(zhǔn)用于滴蟲性陰道炎的診斷［3］。

Affirm核酸雜交技術(shù)是DNA探針與目標(biāo)RNA雜交，顯色探針上連接的酶與底物反應(yīng)，反應(yīng)不需要擴(kuò)增，環(huán)境里的極少量的核酸和微生物基本無干擾，病原體數(shù)量達(dá)到一定的（BV：2×105cfu；VVC：1×104cfu；TV：5×103cfu）顯示陽性，避免了結(jié)果過于靈敏導(dǎo)致的誤判。該檢測(cè)技術(shù)一次取樣可檢測(cè)最常見的3種陰道炎癥，全程自動(dòng)化的處理和讀取樣本，摒棄了樣本遞送和顯微鏡觀測(cè)的人為因素，確保診斷結(jié)果的全面、準(zhǔn)確和穩(wěn)定，本研究顯示核酸雜交檢測(cè)對(duì)混合感染的檢出準(zhǔn)確性明顯高于鏡檢。

綜上所述，AffirmTMVPIII核酸雜交檢測(cè)在BV的診斷方面優(yōu)勢(shì)明顯，在VVC診斷方面與濕片鏡檢相當(dāng)，與真菌培養(yǎng)比較準(zhǔn)確性高，雖然該檢測(cè)成本較高，但其診斷快速、重復(fù)性高，對(duì)混合感染及疑難病例仍有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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