血清膽紅素在肺癌患者中的抗氧化作用

劉利東 馬梓欣 林琪英 周承志

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2輸血科，4廣州呼吸健康研究院、呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國(guó)家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（廣州 510120）；3廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院（廣州 510182）

膽紅素是體內(nèi)鐵卟啉類化合物的降解產(chǎn)物，主要來(lái)源于衰老紅細(xì)胞。血清膽紅素作為肝膽及血液系統(tǒng)疾病的診斷和治療指標(biāo)在臨床應(yīng)用廣泛，并一直認(rèn)為其濃度升高對(duì)人體有害［1］，事實(shí)上膽紅素具有強(qiáng)還原性，在首次被確認(rèn)為內(nèi)源性抗氧化劑后［2］，它的抗氧化功能越來(lái)越受到重視。膽紅素在多種疾病發(fā)病過(guò)程中起重要作用，其中包括惡性腫瘤，但并不具有特異性［3］。肺癌的發(fā)生受多種因素影響，肺癌組織存在氧化/抗氧化失衡，這種失衡可能與肺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)［4］。有研究［5-7］表明在正常范圍內(nèi)較高的膽紅素可以降低肺癌的發(fā)病率，提示膽紅素可能對(duì)肺癌的發(fā)生有一定的抑制作用。為探明膽紅素是否通過(guò)抗氧化作用對(duì)肺癌的發(fā)生造成影響，本文將通過(guò)測(cè)定血清膽紅素、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性和自由基作用于脂質(zhì)的終產(chǎn)物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，分析它們之間的相關(guān)性，了解肺癌患者體內(nèi)存在的氧化應(yīng)激狀態(tài)及膽紅素在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

1.1.1 肺癌患者組2013年1月至2014年11月在廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為肺癌患者為病例組。入選本次研究病例標(biāo)準(zhǔn)為：（1）原發(fā)性肺癌，經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)確診，符合美國(guó)胸科醫(yī)師學(xué)會(huì)（The American College of Chest Physicians，ACCP）肺癌診治標(biāo)準(zhǔn)；（2）經(jīng)病理免疫組化及腹部B超、CT或MR等檢查排除肝膽系統(tǒng)疾病及其他腫瘤；（3）既往無(wú)其他腫瘤病史；（4）未進(jìn)行化療、放療及手術(shù)切除等治療。最終入選402例，其中男234例，女168例，年齡27～86歲，平均（60.09±9.9）歲。按美國(guó)聯(lián)合癌癥分類委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）和國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì)（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）2009年制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)（第7版）［8］進(jìn)行分期，其中 T1 72例，T2 147例，T3 95例，T4 88例。

1.1.2 對(duì)照組隨機(jī)抽取同時(shí)期廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心體檢人群，排除心、腦、肝、膽、腎、內(nèi)分泌疾病及腫瘤等疾病，最終入選422例，其中男199例，女220例，年齡22～80歲，平均（47.15±10.97）歲。

1.2 儀器與試劑膽紅素檢測(cè)儀器為Beckman Coulter AU5821全自動(dòng)生化分析儀及配套試劑、標(biāo)準(zhǔn)品及質(zhì)控品；SOD和MDA測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，分別采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）和硫代巴比妥酸法（TBA法）。

1.3 標(biāo)本采集和處理

1.3.1 對(duì)照者于清晨空腹采取靜脈血3 mL，患者于入院后次日清晨空腹采取靜脈血3 mL，選用含分離膠負(fù)壓采血管采血。室溫，3 300 r/min離心4 min，總膽紅素及結(jié)合膽紅素的檢測(cè)為離心后立刻檢測(cè)，SOD及MDA則取血清置于-40℃冰箱保存，并在3個(gè)月內(nèi)檢測(cè)。

1.3.2 總膽紅素及結(jié)合膽紅素含量的檢測(cè)儀器為Beckman Coulter AU5821全自動(dòng)生化分析儀，試劑為Beckman Coulter配套重氮法檢測(cè)膽紅素試劑盒；104例肺癌患者（其中T1-T4分期分別有16例、35例、31例和22例）和57例健康對(duì)照者檢測(cè)SOD活性與MDA含量的檢測(cè)，操作按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行手工操作，吸光度用752紫外光柵分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均值比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析應(yīng)用配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05時(shí)為組間差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組與肺癌組膽紅素、SOD和MDA的測(cè)定結(jié)果肺癌組結(jié)果與對(duì)照組進(jìn)行比較，總膽紅素、結(jié)合膽紅素及未結(jié)合膽紅素和SOD均有明顯的下降（P＜0.05），而MDA則顯著性升高（P＜0.05）（表1）。這一結(jié)果提示，肺癌患者體內(nèi)膽紅素和SOD水平降低，可能導(dǎo)致患者體內(nèi)抗氧化能力不足的原因，使細(xì)胞更容易遭到體內(nèi)產(chǎn)生的氧化物質(zhì)的破壞，促進(jìn)細(xì)胞癌變。

表1 對(duì)照組與肺癌組膽紅素、SOD和MDA的測(cè)定結(jié)果Tab.1 The concentrations of bilirubin,SOD and MDA in controls and patients with lung cancer ±s

表1 對(duì)照組與肺癌組膽紅素、SOD和MDA的測(cè)定結(jié)果Tab.1 The concentrations of bilirubin,SOD and MDA in controls and patients with lung cancer ±s

注：△部分樣本檢測(cè)，對(duì)照組檢測(cè)57例，肺癌組檢測(cè)104例

2.2 對(duì)照組與不同肺癌分期的測(cè)定結(jié)果為進(jìn)一步研究膽紅素是否與肺癌的發(fā)展有關(guān)，本研究組按肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)將肺癌患者分為T1、T2、T3及T4四組，比較對(duì)照組與不同分期肺癌患者差異。對(duì)照組總膽紅素、結(jié)合膽紅素、未結(jié)合膽紅素、SOD和MDA與肺癌T1～T4組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示總膽紅素和未結(jié)合膽紅素T1～T2期與對(duì)照組差異無(wú)顯著性，與T3～T4組則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而結(jié)合膽紅素與T2～T4組差異有顯著性（表2）。對(duì)照組SOD和MDA與T1～T4組均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。雖然T1～T4各組間所有檢測(cè)項(xiàng)目有一定的變化趨勢(shì)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析相鄰組間差異并沒(méi)有顯著性（P＞0.05，數(shù)據(jù)未顯示）。提示膽紅素可能是在肺癌的發(fā)展中起作用，而在早期肺癌發(fā)生時(shí)變化并不明顯。

2.3 膽紅素與性別關(guān)系有研究［9-10］認(rèn)為膽紅素與性別有關(guān)，為了解性別差異對(duì)膽紅素的影響，我們將對(duì)照組男女之間及肺癌組男女之間的膽紅素進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組女性膽紅素比男性低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但肺癌組男女之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。筆者也分析了所檢測(cè)項(xiàng)目在不同肺癌TNM分組中男女之間差異，結(jié)果顯示并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，數(shù)據(jù)未顯示）。這說(shuō)明健康男性膽紅素比女性高，這一結(jié)果與前期研究一致。但對(duì)于肺癌患者來(lái)說(shuō)，正常的膽紅素抗氧化平衡被破壞，膽紅素水平處于較低水平。

表2 對(duì)照組與肺癌組分期膽紅素的測(cè)定結(jié)果Tab.2 The concentrations of bilirubin in controls and patients in different TNMs ±s

表2 對(duì)照組與肺癌組分期膽紅素的測(cè)定結(jié)果Tab.2 The concentrations of bilirubin in controls and patients in different TNMs ±s

注：*P為對(duì)照組與肺癌患者組各分期均數(shù)兩兩比較

組別對(duì)照組T1分期T2分期T3分期T4分期未結(jié)合膽紅素（μmol/L）10.32±3.00 10.39±3.39 9.99±3.13 9.26±2.66**9.42±2.73*例數(shù)422 72 147 95 88總膽紅素（μmol/L）12.53±3.59 12.50±4.12 11.89±3.73 11.19±3.41**11.44±3.26**結(jié)合膽紅素（μmol/L）2.22±0.66 2.17±0.73 2.00±0.67**2.00±0.71**2.02±0.66*

表3 對(duì)照組與肺癌組分期膽紅素的SOD、MDA測(cè)定結(jié)果Ta.3 The concentrations of SOD and MDA in controls and patients in different TNMs ±s

表3 對(duì)照組與肺癌組分期膽紅素的SOD、MDA測(cè)定結(jié)果Ta.3 The concentrations of SOD and MDA in controls and patients in different TNMs ±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

表4 膽紅素在不同性別的分布Tab.4 The distribution of bilirubin in different genders ±s

表4 膽紅素在不同性別的分布Tab.4 The distribution of bilirubin in different genders ±s

2.4 膽紅素與SOD及MDA的相關(guān)性分析SOD是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化系統(tǒng)，而MDA是脂質(zhì)氧化的產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)膽紅素與SOD和MDA的相關(guān)性分析，除在對(duì)照組中總膽紅素和未結(jié)合膽紅素與SOD有低正相關(guān)（r分別為0.377和0.395，P＜0.05），其余的均無(wú)顯著相關(guān)性。具體相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表5。這一結(jié)果可能是因?yàn)槟懠t素的抗氧化功能與SOD不一樣，膽紅素獨(dú)立發(fā)揮抗氧化功能。

表5 膽紅素與SOD和MDA的相關(guān)性分析Tab.5 The relativity among bilirubin，SOD and MDA

3 討論

腫瘤細(xì)胞過(guò)氧化物酶體的過(guò)氧化氫酶數(shù)量的減少及活性的減弱直接影響了氧化劑的清除，同時(shí)也使自由基的生成增加。有研究表明［11］，血清SOD活性測(cè)定對(duì)判斷腫瘤分期及預(yù)后具有一定意義，亦是檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物之一。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，肺癌患者的SOD活性降低，而MDA含量升高，對(duì)照組與TNM分期T1～T4分期肺癌患者SOD活性和MDA含量差異均有顯著性，但各分期間無(wú)顯著性的變化趨勢(shì)。表明肺癌患者存在著氧化/抗氧化失衡，肺癌腫瘤發(fā)生與抗氧化能力的下降有關(guān)，這與國(guó)內(nèi)前期研究數(shù)據(jù)一致［4，12］。

較早前有研究認(rèn)為與白蛋白結(jié)合的膽紅素（未結(jié)合膽紅素）具有較強(qiáng)的氧自由基清除能力［2，13］，近期研究［14］也認(rèn)為未結(jié)合膽紅素可以抑制鼻咽癌在肺組織中的轉(zhuǎn)移，提高鼻咽癌的無(wú)轉(zhuǎn)移生存率，但它的生物學(xué)作用機(jī)制并不十分明確［15］。膽紅素的抗氧化活性主要在于能清除體內(nèi)的自由基，膽紅素經(jīng)血紅素加氧酶作用后轉(zhuǎn)變?yōu)槟懢G素，再經(jīng)還原酶的作用，轉(zhuǎn)變?yōu)槲唇Y(jié)合膽紅素，在此還原過(guò)程中可提供二個(gè)氫原子，起到抗氧化作用。膽紅素在正常人體內(nèi)濃度約為3.4～17.1 μmol/L，比已知的抗氧化劑谷胱甘肽的組織濃度的0.1%還少，它強(qiáng)大的抗氧化作用是通過(guò)膽綠素還原酶的接觸性擴(kuò)增作用實(shí)現(xiàn)的，占機(jī)體總抗氧化能力的30%左右［16-17］。健康人膽紅素水平并不很高，可能是因?yàn)槟懠t素作為強(qiáng)抗氧化劑在體內(nèi)很快被消耗。雖然有關(guān)肺癌發(fā)生發(fā)展與氧化抗氧化的相關(guān)性分析研究報(bào)道很多，但有關(guān)血清膽紅素在肺癌的病理過(guò)程中的作用研究報(bào)道較少。HORSFALL等［5］通過(guò)統(tǒng)計(jì)英國(guó)綜合醫(yī)療研究數(shù)據(jù)庫(kù)中1988-2008年記錄的504 206名成人的血清總膽紅素?cái)?shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)血液中膽紅素濃度處于正常但卻相對(duì)較高范圍內(nèi)的人，其肺癌、慢性阻塞性肺疾病及全因死亡風(fēng)險(xiǎn)會(huì)有所下降，其中膽紅素濃度增加0.1 mg/dL，男性中的肺癌發(fā)病率會(huì)減少8%，而女性中的肺癌發(fā)病率會(huì)降低11%。WEN等［18］的研究也提示在男性吸煙者中，低水平的血清膽紅素與高肺癌發(fā)生率有相關(guān)。筆者對(duì)比肺癌患者與健康對(duì)照，無(wú)論是總膽紅素，還是未結(jié)合或結(jié)合膽紅素均有明顯下降，兩組差異具有顯著性。肺癌的發(fā)展過(guò)程與細(xì)胞內(nèi)的氧化/抗氧化失衡加重有關(guān)，本研究中T1～T4分期的肺癌患者膽紅素與SOD一樣，呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，提示膽紅素含量的變化可預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。機(jī)體大量的SOD、膽紅素等抗氧化劑在腫瘤組織集中，以清除腫瘤組織產(chǎn)生的氧化物質(zhì)，隨著腫瘤的惡性增強(qiáng)，機(jī)體氧化損傷加劇，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)終極產(chǎn)物增加，抗氧化劑不足以拮抗氧化產(chǎn)物，從而表現(xiàn)為抗氧化劑活性或含量在肺癌中后期較早期下降。

本研究中，在TNM各分期比較中總膽紅素、未結(jié)合膽紅素呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，而結(jié)合膽紅素未出現(xiàn)此趨勢(shì)，可能是結(jié)合膽紅素性質(zhì)上水溶性強(qiáng)，不易通過(guò)生物膜，難與胞內(nèi)氧自由基作用。另外，它作為白蛋白配基雖然也在血漿中轉(zhuǎn)運(yùn)，但其結(jié)合不如未結(jié)合膽紅素緊密，抗氧化性相對(duì)較弱［19］。筆者認(rèn)為膽紅素在肺癌患者中的抗氧化作用主要由未結(jié)合膽紅素作用實(shí)現(xiàn)。雖然膽紅素有抗氧化作用，在肺癌發(fā)生過(guò)程中可清除逐漸增高的自由基，但研究認(rèn)為膽紅素對(duì)白細(xì)胞的抗氧化作用時(shí)發(fā)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下高濃度的膽紅素才具有抗氧化作用［20］。本研究中，肺癌T1和T2分期的膽紅素濃度較T3和T4組的高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（數(shù)據(jù)未顯示），這可能與標(biāo)本量有關(guān)。

有研究認(rèn)為膽紅素與性別相關(guān)［9-10］，男性的外周血循環(huán)膽紅素比女性高，而隨年齡的增長(zhǎng)膽紅素呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常對(duì)照組膽紅素男性比女性高，與前期研究相符，但肺癌組則兩者間差異無(wú)顯著性，可能是因?yàn)榘┳儼l(fā)生后，體內(nèi)的膽紅素抗氧化體系被打亂，不能執(zhí)行正常的功能，均呈現(xiàn)低膽紅素水平。

本研究的初步結(jié)果顯示，正常范圍內(nèi)的膽紅素含量與肺癌有一定的相關(guān)性，濃度變化與肺癌的進(jìn)展也相關(guān)，高濃度的膽紅素可能是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)抗氧化機(jī)制降低肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［21］。研究表明［22］，對(duì)于手術(shù)切除非小細(xì)胞性肺癌患者，術(shù)前膽紅素適當(dāng)升高可以提高總體生存率、無(wú)疾病生存率和無(wú)轉(zhuǎn)移生存率，同時(shí)，結(jié)合膽紅素可以作為一個(gè)對(duì)非小細(xì)胞性肺癌的手術(shù)預(yù)后的指標(biāo)。因本研究是對(duì)肺癌患者的小樣本調(diào)查，其結(jié)果可能會(huì)受到樣本量的影響，還需增加更大的樣本量，從而收集得到的數(shù)據(jù)分析可能會(huì)更有說(shuō)服力。可以建立多中心合作的患者數(shù)據(jù)庫(kù)，可以通過(guò)大量樣本的研究，建立這一疾病的相關(guān)模型，當(dāng)膽紅素水平出現(xiàn)有意義的變化時(shí)，可提示疾病的發(fā)生幾率，早發(fā)現(xiàn)早治療，從而提高疾病的痊愈率及治療后的生活質(zhì)量。

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